PMA处理后「相对丰度+绝对丰度」活菌检测服务

你花几周做出来的16S测序，可能有一大半信号来自已经破裂、早就死掉的细菌DNA。只看相对丰度，不知道绝对量；只看拷贝数，不知道是哪个物种。单一方法无法回答「活菌是谁+活菌有多少」。

微基解决方案：PMA处理后相对丰度+绝对丰度同时检测。同一份样本双路检测：相对丰度（16S 扩增子/宏基因组）+ 绝对丰度（qPCR/ddPCR），把”活菌是谁”和”活菌有多少”一次说清，最终给出每个物种的活菌绝对丰度。

PMA原理：让测序和定量只数“活着”的菌

一、为什么必须区分死/活菌？

微基生物对同一样本同时开展两条技术路线：相对丰度可在16S扩增子测序与宏基因组测序之间灵活选择，绝对丰度路线可在qPCR与ddPCR之间灵活选择。

二、实验流程

同一份样本设置PMA处理（活菌）与未处理（全部细菌）两组，分别走A、B两条技术路线——相对丰度路线可选16S扩增子或宏基因组，绝对丰度路线可选qPCR或ddPCR：

三、您将获得什么？

对同一样本设置不经PMA处理（全部细菌）与经PMA处理（活菌）两组，每组3个平行：

四、适用样本与研究场景

五、文献解读

以上文献均为公开发表的前沿研究，仅供技术原理与结果展示参考。微基生物可基于文中涉及的技术方法，为客户提供对应的科研级检测服务。

文献 ① 定量PMA-16S工作流：把“活菌绝对量”做进生态毒理建模（2025）

技术方法：

以自然海水为研究对象，通过热致死与自然海水混合，制备完整细胞比例梯度（100%、80%、60%、40%、20%、0%）；对同一样本设置PMA处理与未处理对照，以相对丰度路线（16S扩增子测序）配合绝对丰度路线（ddPCR 16S拷贝数/流式细胞术Live/Dead完整细胞数）锚定，建立QMP（定量微生物组学）工作流，直接评估活菌的绝对丰度变化。

关键结果：

① PMA+测序+定量锚点=活菌绝对丰度

图 1｜定量工作流概念图：展示PMA预处理→分子定量（ddPCR）或细胞定量（流式）→16S 测序的整合流程；核心对比 RMP（相对微生物组分析）与 QMP（定量微生物组分析）：RMP只能看到60:40比例不变，QMP能揭示暴露组两个类群绝对丰度均下降50%。

②QMP捕捉到了RMP完全遗漏的种群衰减

图2｜QMP vs RMP核心结果：在完整细胞比例递减梯度中，RMP（左列）在ASV水平几乎看不出丰度变化；以ddPCR（中列）或流式细胞数（右列）为锚点的QMP清晰显示各ASV绝对丰度随完整细胞比例下降而一致衰减。说明不做绝对定量会严重低估环境压力对活菌群落的真实影响。

结论与意义：PMA与分子/细胞定量锚点联用，可将相对测序数据转化为活菌绝对丰度；QMP能揭示RMP无法检测的ASV水平衰减，为环境压力响应建模、生态毒理阈值推导提供可量化的活菌数据。

文献 ② PMA-PCR+ 16S+ qPCR：揭开厌氧污泥里的真实活菌群落（2020）

技术方法：

采集5座全规模厌氧污泥消化罐（AKT、NGT、NIT、SEN、TNN）的消化污泥（DS）样本，同步设置PMA处理组与未处理对照组；以相对丰度路线（16S rRNA V3-V4区扩增子测序）解析活菌群落结构，并以绝对丰度路线（qPCR，SYBR Green）定量总16S拷贝数，进而区分“活菌”与“死菌/残留”对群落结构和数量的贡献。

关键结果 ①PMA处理后多样性指数显著下降：大量OTU来自死菌。

图1｜PMA处理后OTU数与α多样性显著下降：与未处理组（DS）相比，PMA处理组（DS-PMA）的OTU数、Chao1和 Shannon指数均明显降低；部分样本中DS-PMA多样性甚至低于进泥（WAS）与初沉污泥（PS），说明常规测序中相当一部分OTU实际来自膜破损细胞或游离DNA。

② 群落结构被“重写”：死菌主要来自变形菌门。

图2｜PMA处理前后门/纲水平群落组成变化：PMA处理后Alphaproteobacteria和Betaproteobacteria相对丰度大幅下降，部分样本中Betaproteobacteria下降96-99%；而 Bacteroidetes、Chloroflexi、Firmicutes、WWE1、产甲烷古菌等被认为是真正的活性核心成员。

③ qPCR定量：死菌占5-30%，类群间差异巨大。

图3｜PMA处理前后各主要类群基因拷贝数变化。热图展示各消化罐污泥样本中主要微生物类群的 qPCR基因拷贝数比率变化：黑色数字表示PMA处理后拷贝数比例上升，红色数字表示下降。Alphaproteobacteria/Betaproteobacteria基因拷贝数经PMA后下降40-99%，而Deltaproteobacteria、WWE1、Bacteroidetes等受影响很小。提示它们是真正稳定的活性核心成员。

结论与意义：PMA-PCR结合16S 测序与qPCR，能有效剥离残留死菌信号，还原复杂环境样本中的真实活菌群落；该研究也提示：不做死活区分，常规测序会严重误判厌氧消化体系中的核心功能菌与生态关系。

想看看您的样本里，到底有多少菌是“活”的？欢迎联系微基生物，PMA活菌检测方案。

咨询电话021-50763698

参考文献：

1.Thomas M.C., et al. (2025). Development of a quantitative PMA-16S rRNA gene sequencing workflow for measuring absolute abundance of seawater microbiomes. Environmental Microbiome 20:81. doi:10.1186/s40793-025-00741-2

2.Ni J., Hatori S., Wang Y., Li Y.-Y., Kubota K. (2020). Uncovering viable microbiome in anaerobic sludge digesters by propidium monoazide (PMA)-PCR. Microbial Ecology 79:855–865. doi:10.1007/s00248-019-01445-3