格微®甄选 菌种特异性16S FISH探针设计服务

细菌存在于根尖周炎牙髓病灶的组织切片中

格微®甄选  菌种特异性16S FISH探针设计服务

Ø 从198万条已知的全部16S数据库中，评测目标微生物全部可能的FISH探针，报告出高特异性的一条，以及可能的错配（基于目前全部的198万条16S序列）。    

Ø 如单条FISH探针，特异性不佳（很难精确到菌种），则评估双FISH探针（两条目标区域独立、不重合的16S FISH探针）的特异性情况，给出详细的解读报告。

Ø 介于23S已知序列条数约22.7万条，只有16S已知序列1/10的数量，我们FISH探针的设计都基于16S序列开展。

微基生物尽力为客户提供优秀的细菌特异性探针为目标，利用当前较为完善的数据库系统及自身开发的程序完成对16S序列数据库全面筛选匹配，协助科研客户挑选出特定菌种特异性优秀的探针。咨询电话：021-50763698。

细菌FISH检测的原理

细菌FISH检测是以微生物中较稳定的rRNA (主要是16S和23S) 作为分析的目标，以rRNA序列设计探针进行杂交，对待检测的微生物分布情况和特征性的微生物进行鉴定与定量分析，提供微生物形态学、空间分布和生物体的细胞数量等信息。

FISH杂交模式图            新型寡聚核苷酸荧光原位杂交：发展与应用 2023年

样本类型

粪便、土壤、水样、昆虫、植物根部、口腔唾液、肿瘤组织等

 

FISH探针设计、评估报告

1.单探针效果很好，乙方提供单探针设计、项目报告。提供序列信息和探针。

Dubosiella newyorkensis 单探针特异性较好

目标物种名称：Dubosiella newyorkensis，属于目标物种的16S序列有2条（下称目标16S序列库），Dubosiella的物种有310条，属于非目标物种的序列有1796188条（下称非目标序列库）。

单探针在库中匹配情况统计：

p1_目标mismatch0_count	p1_目标mismatch1_count	p1_目标mismatch2_count	p1_目标mismatch3_count	p1_目标mismatch0_percent	p1_目标mismatch1_percent	p1_目标mismatch2_percent	p1_目标mismatch3_percent
2	2	2	2	100	100	100	100

 

2.单探针效果不好，乙方在设计过程中自动升级提供双探针设计、项目报告。提供序列信息和探针。 

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi  单探针设计不好，双探针显著改善。

目标物种名称：Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi，属于目标物种的16S序列有96条（下称目标16S序列库），Salmonella enterica的物种有1792条，属于非目标物种的序列有1796094条（下称非目标序列库）。

设计的第一条探针在库中匹配情况统计：

p1_非目标mismatch0_count	p1_非目标 mismatch1_count	p1_非目标 mismatch2_count	p1_非目标 mismatch3_count	p1_start
3453	6317	9039	10828	447

 

p1_目标mismatch0_count	p1_目标mismatch1_count	p1_目标mismatch2_count	p1_目标mismatch3_count	p1_目标mismatch0_percent	p1_目标mismatch1_percent	p1_目标mismatch2_percent	p1_目标mismatch3_percent
92	93	93	93	95.83333	96.875	96.875	96.875

 

设计的第二条探针在序列库中匹配情况统计：

p2_非目标mismatch0_count	p2_非目标 mismatch1_count	p2_非目标 mismatch2_count	p2_非目标 mismatch3_count	p2_start
69282	85392	87251	89460	843

 

p2_目标mismatch0_count	p2_目标mismatch1_count	p2_目标mismatch2_count	p2_目标mismatch3_count	p2_目标mismatch0_percent	p2_目标mismatch1_percent	p2_目标mismatch2_percent	p2_目标mismatch3_ percent
95	95	95	95	98.95833	98.95833	98.95833	98.95833

 

两条探针分别匹配数据库后，共同击中非目标序列库的序列条数：

p12_非目标 mismatch0_count	p12_非目标 mismatch1_count	p12_非目标 mismatch2_count	p12_非目标 mismatch3_count
3336	6187	8893	10694

说明：

1. p*n_非目标mismatch*_count：探针prob1或2与非目标序列库进行匹配，分别统计mismatch为0.1.2.3时的序列条数。

2.p*_start：探针prob1或2在16S序列上的起始位置。

3. p*_目标mismatch*_count：探针prob1或2与目标16S序列库匹配的条数，分别统计mismatch为0.1.2.3时的序列条数。

4 .p*_目标mismatch*_percent：探针prob1或2与目标16S序列库匹配序列条数对应的百分比，分别统计mismatch为0.1.2.3时的序列条数的百分比。

建议：单条FISH探针特异性较差，如需提高特异性，建议合成第二条探针（标记不同荧光），进行双FISH探针杂交检测。

 

文献解读     一、特异性荧光原位杂交探针的设计

鼠李糖乳杆菌Probio-M9的特异性荧光原位杂交探针设计及应用 2021

目的  为了研究特定菌株在宿主肠中的定植和精确定位，使用荧光原位杂交定位鼠李糖乳杆菌 Probio–M9。

实验设计  

1.鼠李糖乳杆菌种水平特异性探针（Probe-16S）设计

根据现有的乳杆菌的基因组信息，筛选鼠李糖乳杆菌基因组的特定片段，根据鼠李糖乳杆菌的16S序列设计了特异性探针（5’-CGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACC-3’）， 并在5’端用6-羧基荧光素（6-FAM）荧光基团修饰。杂交优化后，使用鼠李糖乳杆菌的15个代表性菌株和乳杆菌相关属的15个代表性菌株和乳杆菌相关属的15个代表性菌株测试了探针16S的特异性。

2.鼠李糖杆菌Probio-M9菌株水平特异性探针（Probe-SP）设计

根据现有乳酸杆菌的基因组信息，首先筛选鼠李糖乳杆菌基因组的特定片段，然后将鼠李糖乳杆菌不同菌株的基因组与Probio-M9菌株的基因组进行比较和分析，以筛选特异性基因组片段。基于该片段，设计了Probio-M9菌株的水平特异性探针（5′-CCAACTGACGCCTTCACTTCG）。 使用鼠李糖乳杆菌的15个代表性菌株和来自乳杆菌的相关属的15个代表性菌株测试探针-SP 的特异性。

结果展示

本研究针对鼠李糖乳杆菌Probio-M9和其它相关物种的基因组序列，分别设计了种水平特异性探针（Probe-16S）和菌株水平特异性荧光原位杂交探针（Probe-SP），并通过对15株鼠李糖乳杆菌菌株和15株其它益生菌进行探针特异性的验证；同时结合荧光D-氨基酸（FDAA）代谢探针，在大鼠的肠道中检测到鼠李糖乳杆菌Probio-M9的活细胞。本方法在在摄入鼠李糖乳杆菌Probio-M9菌株后可利用该探针检测及定位宿主肠道内的鼠李糖乳杆菌Probio-M9， 为以后开发和利用Probio-M9提供更多的理论依据。

 

 

二、荧光原位杂交确定肿瘤内微生物的存在

Intratumoural microbiome can predict the prognosis of hepatocellular carcinoma after surgery 2023

实验目的及实验设计  使用荧光原位杂交法测定了肿瘤内微生物组的存在，并用16S rDNA测序法研究了肿瘤和邻近正常组织中的微生物群落分布。对配对组的微生物特征进行了鉴别，并进一步研究了它们与临床特征的相关性。用肝型对肿瘤组织的微生物特征进行分类，进一步分析了肝型的独立预后价值。

部分结果展示                     肝癌中存在微生物

为了揭示肝癌中微生物群的存在，使用UB388探针对肿瘤样本进行FISH检测。

（图A）通过检测FISH信号证实了肝细胞癌中存在细菌。EUB388探针（红色）和DAPI（蓝色）染色的肿瘤样品中细菌16S rRNA的FISH分析。

（图B）表明一些FISH信号存在于CD8+细胞中，表明CD8+细胞中存在细菌。细菌16S rRNA与免疫细胞共染色。CD8+T细胞用粉色(B)标记。

（图C）CD68+巨噬细胞倾向于分布在瘤内微生物更丰富的区域，提示瘤内微生物组可能影响肝癌中巨噬细胞的浸润。巨噬细胞用绿色(C)标记。

肿瘤和邻近正常组织中不同的微生物分布

对91名肝癌患者的肿瘤样本和邻近样本进行检查。肝细胞癌(HCC)肿瘤和邻近正常组织中微生物组的表征。

（图A）а-多样性显示肿瘤和邻近组织之间没有显着差异（p=0.436）。

（图B）β多样性揭示了肿瘤组和正常组之间的显着差异（p<0.001）。

（图C）PLS-DA揭示了两组之间的多样性。四个细菌门（变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和奇球菌-栖热菌门）占序列的90%。

（图D）四个门在肿瘤和邻近正常组织中均占优势。

本实验中使用荧光原位杂交确定了肿瘤内微生物组的存在，具有特异性好、定位准确、 检测时间短，试验周期短等的优势，更适于肿瘤样本微生物多样性的检测。