特定种类微生物检测

 1 检测对象

关于特定种类的微生物，客户可告知物种信息及引物信息，微基生物针对目标微生物进行qPCR定量分析；也可告知感兴趣的物种名称，微基生物来查询相关引物信息；如老师感兴趣的物种信息尚未见文献报道，微基生物可以开发程序，自行研发寻找目标菌株的特异基因并设计目标菌株的特异引物，验证引物的特异性，进行后继实验。
微基生物已检测过的物种信息，见表格（仅列出了常见的部分微生物种类），其他的微生物也可以检测。

级别	中文名称	英文名称
界	细菌	Bacteria
界	真菌	Fungi
界	古菌	Archaea
门	放线菌门	Actinobacteria
门	拟杆菌门	Bacteroidetes
门	厚壁菌门	Firmicutes
纲	alpha变形菌纲	Alpha-proteobacteria
纲	gamma变形菌纲	Gamma-proteobacteria
科	肠杆菌科	Enterobacteriaceae
科	瘤胃球菌科	Ruminococcaceae
属	双歧杆菌属	Bifidobacterium
属	大肠杆菌属	Escherichia
属	乳酸杆菌属	Lactobacillus
属	梭菌属	Clostridium
属	肠球菌属	Enterococcus
属	拟杆菌属	Bacteroides
属	奇异菌属	Atopobium cluster
属	链球菌属	Streptococcus
属	瘤胃球菌属	Ruminococcus
属	粪杆菌属	Faecalibacterium
属	布劳特菌属	Blautia
属	艰难梭菌属	Clostridium difficile
属	脱硫弧菌属	Desulfovibrio
属	另支菌属	Alistipes
属	链球菌属	Streptococcus
属	萨特氏菌属	Sutterella
属	丙酸杆菌属	Propionibacterium
属	假单胞菌属	Pseudomonas
属	噬酸菌属	Acidovorax
属	不动杆菌属	Acinetobacter
属	鞘氨醇单胞菌属	Sphingomonas
属	分枝杆菌属	Mycobacterium
属	普氏菌属	Prevotella
种	溶纤维丁酸弧菌	Butyrivibrio fibrisolvens
种	蛋白溶解梭菌	Clostridium proteoclasticum
种	金黄色葡萄球菌	Staphylococcus aureus
种	青春双歧杆菌	Bifidobacterium adolescentis
种	鼠李糖乳杆菌	Lactobacillus rhamnosus
种	粪肠球菌	Enterococcus faecalis
种	呀卟啉单胞菌	Porphyromonas gingivalis
种	阴道加德纳菌	Gardnerella vaginalis
种	鼠乳杆菌	Lactobacillus murinus
种	解淀粉芽孢杆菌	Bacillus amyloliquefaciens
种	芽孢杆菌	Bacillus velezensis
种		Akkermansia muciniphila
种	酿酒酵母	Saccharomyces cerevisiae
株	唾液链球菌 K12	Saliva streptococcs

 2 qPCR的原理

实时荧光定量PCR技术（Real-timeQuantitativePCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终通过相对定量（与内参基因对比）或绝对定量（通过标准曲线对未知模板进行定量）的方法确定各个样本的本底表达量。

 3 3种荧光试剂的工作原理及区别

SYBRGreenⅠ法：

嵌入到双链DNA分子后在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后构象发生变化，能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光；而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

TaqMan探针法：

扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步

 SYBRGREEN法和TaqMan探针法的区别

方法	优点	缺点
SYBR GREEN法	高灵敏度，操作简单，不影响酶促反应，价格便宜	1与探针法相比，对引物特异性要求较高，需进行熔解曲线分析 2灵敏度相对较低。
TaqMan 探针法	1具有高度特异性 2更高的灵敏度 3可同时检测几种不同的荧光信号的产物	1探针价格较高 2需要不同引物的扩增效率一致，对引物的设计及扩增条件要求比较高

 4 qPCR的实验方法

实验方法	原理	技术应用	相关应用
绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ)	是测定目的基因在样本中的分子数目，通过构建标准曲线对未知模板进行分子数目的定量，即通常所说的拷贝数。	特定微生物的拷贝数检测 特定功能基因的拷贝数检测 特定抗性基因的拷贝数检测	1临床疾病诊断 2动物疾病检测 3食品安全 4科学研究 5应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
相对定量(RelativeQuantification，RQ)	测定目的基因在样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的绝对拷贝数，一般是通过CT值之差来计算。	样本中某种特定微生物拷贝数占全部微生物拷贝数的比例 某种功能基因的微生物拷贝数占全部微生物拷贝数的比例 某种抗性基因拷贝数占全部微生物拷贝数的比例

 相对定量和绝对定量的数据计算方法

标准质粒拷贝数计算：

每微升拷贝数（copies/μl）=[质粒浓度（ng/ul）×10-9×6.02×1023]/克隆产物相对分子质量
原始样本目标基因拷贝数copies/μLDNA=拷贝数*稀释倍数
原始样本目标基因拷贝数copies/g样本=（原始样本目标基因拷贝数copies/μLDNA*基因组DNA体积）/样本抽提重量，（如果客户样本为DNA样本，则不需要计算copies/g样本）

相对定量的计算：

步骤1:内参基因均一化样本差异：Ct目的基因–Ct内参基因=△Ct

步骤2:其他样本和对照样本比较：△Ct处理样本–△Ct对照样本=△△Ct

步骤3:使用公式计算：倍数变化=2-△△Ct

 5 qPCR的实验流程

 6 qPCR检测送样要求

	样本类型	样品量/例	备注
环境	土壤/沉积物/淤泥	1g
	湖水/海水/河水	1L，用滤膜或离心富集	过 0.22μm 的滤膜，或者 12000rpm 离心，进行富集。
	污水	20ml	若样本清亮则可适当地多取。
	泥水混合样	2ml
	空气	根据实验需要，用无菌滤膜过滤空气。
	发酵物	固体 2g，液体 20ml

	样本类型	样品量/例	备注
人体	粪便	≥3g
	皮肤	5 个采集拭子	采集 5cm*5cm 面积，反复刮取 20 次。
	生殖道	5 个采集拭子	采集阴道口内 4cm 处分泌物， 每个拭子转 3 圈。
	牙菌斑/舌苔	5 个采集拭子	在采集的部位，刮取 10 次左右。
	唾液	10ml
	痰液	10ml 或 2-3 口痰液
	鼻腔	5 个采集拭子	采集鼻腔内粘膜上的分泌物，转 3 圈。
	肺部灌洗液	30ml 富集液	对灌洗液进行离心富集。
	肠道/胃组织	5mm*5mm*3mm 3 块	尽量多一取些。
	血液	3ml 全血	用 EDTA 抗凝管，颠倒 8-10 次。 不建议用肝素。
	尿液	30mL 尿液	取中段尿为宜。
	母乳	5mL
动物	粪便	≥3g	最少 0.05g。
	盲肠/结肠/胃 组织	≥3g	至少 1g，如果实验条件允许，尽可能多的收集样本
	肠道内容物	≥3g	最少 0.05g。建议客户自己取内容物，可以用 PBS 冲洗。

提醒

1 因为qPCR绝对定量最终得到的是单位重量，或是单位体积目标基因的拷贝数，所以如果客户送DNA，建议客户记录抽提DNA时样本的使用重量或是体积，方便后继对数据进行转化。

2 送样时请尽量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保证运输过程中的低温条件（干冰的挥发消耗量约为 3-4 公斤/天）。在打包时放入足量的干冰， 将样本埋入干冰中， 为了保持冰盒中的低温环境，建议采用加厚的泡沫盒

 7 qPCR结果

标准曲线

扩增曲线

熔解曲线

定量结果

微基编号	拷贝数	样本稀释倍数	抽提样本重量（g）	基因组DNA体积（μL）	原始样本目标基因拷贝数copies/μL DNA	原始样本目标基因平均拷贝数copies/μL DNA	原始样本目标基因拷贝数copies/g样本	原始样本目标基因平均拷贝数copies/g样本
1	1.08E+06	200	0.237	50	2.17E+08	2.26E+08	4.58E+10	4.76E+10
1	1.23E+06	200	0.237	50	2.47E+08		5.20E+10
1	1.07E+06	200	0.237	50	2.14E+08		4.51E+10
2	7.28E+05	200	0.24	50	1.46E+08	1.49E+08	3.03E+10	3.09E+10
2	7.55E+05	200	0.24	50	1.51E+08		3.15E+10
2	7.44E+05	200	0.24	50	1.49E+08		3.10E+10
3	1.24E+06	200	0.25	50	2.48E+08	2.59E+08	4.96E+10	5.19E+10
3	1.35E+06	200	0.25	50	2.69E+08		5.39E+10
3	1.30E+06	200	0.25	50	2.61E+08		5.21E+10
4	1.61E+06	200	0.234	50	3.21E+08	3.22E+08	6.87E+10	6.87E+10
4	1.60E+06	200	0.234	50	3.19E+08		6.82E+10
4	1.62E+06	200	0.234	50	3.24E+08		6.93E+10
5	1.27E+05	200	0.175	50	2.54E+07	2.66E+07	7.25E+09	7.59E+09
5	1.33E+05	200	0.175	50	2.66E+07		7.61E+09
5	1.39E+05	200	0.175	50	2.77E+07		7.91E+09

 8 术语解释

Ct值（Cyclethreshold，循环阈值）：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
荧光阈值（threshold）的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10*SDcycle3-15
基线（baseline）：在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，即称为基线。
熔解曲线Tm（TmOfMeltingCurve）：SYBRGreen染料发实验结束后需对qPCR产物加热，随着温度的升高，双链接扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降，将此温度称为Tm值。不同PCR产物Tm值不同，从而可对PCR的特异性进行鉴定。

 9 参考文献

1 Tristano Bacchetti De Gregoris et.al. Improvement of phylum- and class-specific primers for real-time PCR quantification of bacterial taxa.2011. Journal of Microbiological Methods.（厚壁菌门拟杆菌门alpha变形菌gamma变形菌等）

2 Baskar Balakrishnan et.al. Development of a real-time PCR method for quantification of Prevotella histicola from the gut.2017.Anaerobe.（普氏菌）

3 John Penders et.al. Quantification of Bifidobacterium spp., Escherichia coli and Clostridium difficile in faecal samples of breast-fed and formula-fed infants by real-time PCR.2005. FEMS Microbiology Letters.（双歧杆菌艰难梭菌大肠杆菌探针法）

4 Anders Bergstrom et.al. Introducing GUt Low-Density Array (GULDA) – a validated approach for qPCR-based intestinal microbial community analysis.2012. FEMS Microbiology Letters.（多种菌的定量）