1  基本概念

2  血液微生物组样本采集方法与注意事项

2.1全血取样：研究血液微生物多样性的首选

全血样本可完整保留血浆、红细胞、白细胞等各组分中的微生物及其遗传物质，是全面分析血液微生物群落的核心选择。经优化检测流程处理后，微生物检出效率与红细胞层/血细胞层样本一致性达98%以上，且无需额外离心分层，操作简单，污染风险低。

2.1.1全血样本采样步骤

采样前准备：选择符合实验条件的受试者，告知实验相关信息并签署知情同意书；准备EDTA或肝素抗凝采血管、一次性采血针、无菌注射器、冰浴设备等，确保所有耗材无菌。

采集操作：采集2-5mL外周血于抗凝采血管中或进口离心管中（提前添加抗凝剂）。轻轻颠倒摇晃混匀（不可剧烈摇晃，以防溶血）。

 

2.2血液中不同组分的取样：针对性研究特定微生物群落

若需聚焦特定血液组分中的微生物，可采集全血后在实验室规范离心分层，再选取目标组分检测。建议先采集全血，再进行离心处理，既满足分层样本需求，又可保留全血样本以备复检或其他检测。

血浆：微生物含量极低（仅占0.03%），聚焦细胞游离微生物DNA（cfmDNA），适用于感染早期诊断、疾病相关微生物标志物筛选等研究。

Buffy 层（白细胞层）：微生物DNA含量最丰富，适用于高灵敏度微生物DNA检测，尤其适合研究胞内寄生微生物及极低丰度的微生物。

红细胞层：含少量微生物DNA，适合分析红细胞内寄生微生物，避免溶血影响核酸提取效率。

2.2.1分层样本采样步骤

采样前准备：与全血采样一致，需额外准备低温离心机、无菌离心管等设备。

全血采集：采集2-5mL外周血于抗凝采血管中或进口离心管中（提前添加抗凝剂），轻轻颠倒摇晃混匀（不可剧烈摇晃，以防溶血），4℃或冰浴静置约10min，先低温低速离心（3000rpm，10min，4℃），使血液分为血浆层（上层）、白细胞和血小板层（中层）、红细胞层（下层）。用无菌移液器或吸管分别吸取目标组分。

2.3注意事项

a）不要使用无抗凝剂的采血管（凝血后，微生物基因组提取变得非常困难）。

b）采血过程需等消毒剂（乙醇、异丙醇等）完全挥发后采样。

c）采集过程中，样品放置时间，离心时间、等保持一致。

d）红细胞/血细胞层得率约50%，1mL外周血可得约0.5mL血细胞层。

e) 样本按500μL/支分装，方便后继需要多次检测，尽量避免样本多次冻融。

f）血细胞层如发生溶血（冻存前或冻存后），只要不凝块，不影响微生物基因组DNA提取。

3  血液代谢组样本采集方法与注意事项

3.1 血浆样本代谢组检测 

3.1.1 采集步骤

采集2-5mL外周血于抗凝采血管中或进口离心管中（需提前添抗凝剂），轻轻颠倒摇晃混匀（不可剧烈摇晃，以防溶血），4℃或冰浴静置约10min，先低温低速离心（3000rpm， 10min，4℃），取大部分上层血浆，200μL分装到洁净螺口管中，液氮速冻15min（可省略）。

3.1.2注意事项

a) LC-MS平台推荐使用肝素钠/EDTA 抗凝，NMR平台推荐使用肝素钠抗凝；血浆样品不推荐使用柠檬酸做抗凝剂，因为柠檬酸是TCA循环中的重要物质，使用柠檬酸钠抗凝剂会引入外源污染。而EDTA会影响NMR采谱。需注意肝素钠会对RNA相关的实验有负面作用，主要是因为会抑制反转录酶活性。请根据实验需求选择合适抗凝管。

b）采血过程需等消毒剂（乙醇、异丙醇等）完全挥发后采样。

c）采集过程中，样品放置时间，离心时间等保持一致。

d）分装使用的离心管尽可能使用低吸附离心管。

e）血浆得率约50%，1mL外周血可得约0.5mL血浆。

f) 样本按200μL/支分装，是方便后继需要多次检测，应尽量避免样本多次冻融情况。

3.2血清样本代谢组检测

3.2.1 采集步骤

采集2-5mL外周血于无任何添加剂的采血管或进口离心管中，轻轻颠倒摇晃混匀（不可剧烈摇晃，以防溶血），4℃或冰浴静置约1h（确认凝集出血块），先低温低速离心（3000rpm，10min，4℃）；取大部分上层血清，将上述血清按200μL/支，分装至螺口管中，液氮速冻15min（可省略）。如血清量不够，可再次高速离心（12000rpm，10min，4℃），取剩余少量上层血清，如发生溶血，则不可再取/用。

3.2.2 注意事项

a）血清样品推荐使用无采任何添加剂的采血管（不用有促凝剂的采血管）。

b）采血过程需等消毒剂（乙醇、异丙醇等）完全挥发后采样。

c）采集过程中，样品放置时间，离心时间等保持一致。

d）血清得率约30-50%，1mL外周血可得约0.3-0.5mL血清。

e) 样本按200μL/支分装，是方便后继需要多次检测，应尽量避免样本多次冻融情况。

4 推荐采样量

5  样本的保存和寄送

短期保存（≤24小时）：采集后立即置于4℃冷藏保存，避免室温放置超过4小时。分层样本需单独密封保存，防止交叉污染，尤其血浆样本需避免与细胞组分接触导致游离DNA降解。

长期保存（>24 小时）：样本按对应分装标准分装入洁净螺口管，避免反复冻融。-80℃冰箱可保存6-12个月，-20℃冰箱可短期保存1-3个月。

特殊注意事项：

需保留微生物活性或进行微生物培养的样本，必须使用抗凝剂防止凝固，存放于室温或4℃冰箱，且需尽快开展后续实验，不宜长期存放。

冷冻后的全血样本解冻后，轻微溶血可正常检测；严重溶血（血液呈酱油色）需重新采集，避免血红蛋白干扰核酸提取。

若无法实现低温保存，可使用微基生物研发的微生物DNA常温采集保存套装，样本可在常温下稳定保存14天。 

 

6  附（抗凝管的种类和颜色）

提示：血液样本的代谢组学检测，采血管只接收红盖（无添加），绿盖（添加肝素钠），紫盖（添加EDTA）。禁用PAXgene管，添加促凝剂的红盖管等。

 

7 常见问题解答

1）全血样本与分层样本的检测结果有差异吗？

无显著差异，全血样本经优化检测流程后，微生物检出效率与红细胞层/血细胞层样本一致性达98%以上，不影响检测准确性。

2）忘记加抗凝剂的全血样本还能检测吗？

不可检测。未抗凝的血液会发生凝固，导致细胞裂解和微生物失活，严重影响检测结果。

3）全血样本可以检测哪些微生物？

适用于检测细菌、真菌、病毒、非典型病原体等多种微生物。全血mNGS技术可以同时检测数千种微生物，提高了检测的全面性。

4）采血量对检测结果有影响吗？

有影响，采血量直接影响检测的灵敏度。推荐按标准采血量采集，采血量不足会降低微生物检出率。

5）可以使用不同类型的抗凝剂吗？

推荐使用EDTA抗凝剂；肝素抗凝剂也可使用，但需注意其可能抑制某些PCR反应；不推荐使用枸橼酸钠抗凝剂。

6）可以检测到所有病原体吗？

目前没有任何一种方法可以检测到所有病原体。不同检测方法各有优劣，微基生物可根据您的临床需求选择合适方法，必要时联合多种方法提高检出率。