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GC-MS非靶向代谢组

 1 分析原理

GC-MS是气相色谱-质谱联用仪,多应用于医学、物理学,气相色谱的流动相为惰性气体,气-固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。
当多组分的混合样品进入色谱柱后,由于吸附剂对每个组分的吸附力不同,经过一定时间后,各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。吸附力弱的组分容易被解吸下来,最先离开色谱柱进入检测器,而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来,因此最后离开色谱柱。如此,各组分得以在色谱柱中彼此分离,顺序进入检测器中被检测、记录下来。
质谱分析是一种测量离子荷质比(电荷-质量比)的分析方法,其基本原理 是使试样中各组分在离子源中发生电离,生成不同荷质比的带正电荷的离子,经加速电场的作用,形成离子束,进入质量分析器。在质量分析器中,再利用电场和磁场使发生相反的速度色散,将它们分别聚焦而得到质谱图,从而确定其质量。

 2 实验方法

方法流程,代谢组,检测方法,流程

 3 仪器及优势

仪器

Agilent GC-FID-MS

LECO Pegasus 4D GC*GC-TOF MS

气相色谱(GAS CHROMATOGRAPHY,GC)具有极强的分离能力,在精确度上远胜同类仪器;系统的生态运行模式(ECO MODE)可以减少仪器待机时电能和载气不必要的消耗;气相色谱法–质谱法联用(GC-MS)是一种结合气相色谱和质谱的特性,在试样中鉴别不同物质的方法。 其主要应用于工业检测、食品安全、环境保护等众多领域。如农药残留、食品添加剂等;纺织品检测如禁用偶氮染料、含氯苯酚检测等。化妆品检测如二恶烷,香精香料检测等;电子电器产品检测,如多溴联苯、多溴联苯醚检测等;物证检验中可能涉及各种各样的复杂化合物,气质联用仪器对于这些司法鉴定过程中复杂化合物的定性定量分析提供强有力的支持。

 4 结果展示

图1上,PCA,PLS-DA,分析,多元,组图,整体,样本特性

图1下,PCA,PLS-DA,分析,多元,组图,整体,样本特性

 差异物质筛选

代谢物的定性方法为:使用Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.06.00 software将差异离子的精确分子量及MS/MS图谱与本地数据库进行比对。比对时加成方式正离子模式选择[M+H]+和[M+Na]+,负离子模式选择[M-H]-和[M+FA-H]-,质量误差值选择30 PPM,并且从搜到的物质中移除肽、药物和毒物。

图2上,差异代谢物,矩阵,相关性

图2下,差异代谢物,热图,相关性,分析

 通路分析

使用MetaboAnalyst在线分析软件将HFD组和ND组的差异代谢物对应的KEGG编号找出来,通路分析物种选择Mus musculus。将p value < 0.05的通路在KEGG中找出来。HFD组和ND组差异代谢物通路富集分析见图3上,显著的通路见图3下.

图3上,代谢通路,影响因子,分析

图3下,代谢通路,KEGG代谢途径,分析

 5 文献案例

案例分析

文献1

这篇文章是2017年6月发表在Nature Medicine杂志上的一篇高分论文,此研究以年轻人作为研究对象,联用了代谢组学和基因组学,先在基因组学方向上,使用宏基因组测序阐述了中国人群中肠道菌群的变化,然后通过代谢组学分析得到氨基酸循环与肥胖之间的关系,文章的最后确定了一个对肥胖有抑制作用的微生物,多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)。

文献2

a.宏基因组测序并分析 b.将测序结果与患者表型关联 c.基于测序结果的基因功能与代谢通路分析 d.人血液循环代谢物的分析 e.小鼠模型验证 f.干预治疗
本研究中融合宏基因组测序、疾病症状观察、血清代谢组学研究(广筛和靶向)、小鼠喂食模型和数据分析。首先,研究人员对72名肥胖者和79名苗条的“对照组”志愿者进行了肠道微生物的宏基因组测序,得到了35024个与肥胖相关的基因,把这些基因聚类到宏基因组关联群组(metagenomic linkage groups,MLGs),并鉴定出它们所对应的微生物。结果显示,肥胖人群和苗条人群的肠道微生物确实存在巨大差异,且肥胖志愿者的肠道微生物多样性和基因数量都相对较低。
同时,利用GC-MS平台对志愿者血清样本进行代谢组广筛,得到了148种代谢产物,其中确定结构的有13种,包括谷氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸,之后用靶向氨基酸检测进行验证。接着,用宏基因组得出来的结论与代谢组检测结果进行关联分析,发现肥胖人群中谷氨酸的含量非常高,与苗条人群的差异也最大,且在肥胖人群中,谷氨酸含量与多形拟杆菌数量呈反比。

文献3

a.利用Co-inertia analysis方法对217个MLGs和148种代谢产物进行关联。
b.利用典型相关分析(Canonical correlation analysis ,CCA)算法计算20种氨基酸和217个具显著差异MLGs的相关性。
研究人员分别给正常与高脂饮食的小鼠移植了多形拟杆菌,发现正常小鼠的总脂肪量减少、肌肉量增加;高脂饮食小鼠体重增长速度也有所减慢。
最后,研究人员找到了23名接受过袖状胃切除术的志愿者,并收集了他们在刚刚做完手术、术后1个月和3个月的粪便样本,对肠道微生物以及代谢物等的变化进行了分析。
结果显示,接受手术的志愿者体重迅速减少,高血糖、胰岛素抵抗和炎症反应显著减轻,代谢循环中的谷氨酸含量也大大减少。更重要的是,他们肠道中的多形拟杆菌数量随着体重的下降慢慢增加。

参考文献

1 植物代谢组学的典型,研究以质谱为基础,进行了一些了的整合分析。Bais P., et al. 2012. Plantmetabolomics.org: mass spectrometry-based Arabidopsis metabolomics- database and tools update. Nucleic Acids Res. 2012 Jan;40(Database issue):D1216-20. doi: 10.1093/nar/gkr969. Epub 2011 Nov 10.

2 非靶向代谢组学的实际案例,文章使用气相色谱/质谱代谢组学平台。Tsugawa H., et al. 2011. Practical non-targeted gas chromatography/mass spectrometry- based metabolomics platform for metabolic phenotype analysis. J Biosci Bioeng. 2011 Sep;112(3):292-8. doi: 10.1016/j.jbiosc.2011.05.001. Epub 2011 Jun 8.