抗性基因检测

抗性基因即抗性的遗传因子，是选择基因的一种。目前由于大量抗生素在人类医药业、畜牧养殖业滥用，导致了人体或动物体内抗生素抗性基因(ARGs)的产生，不可避免的导致耐药微生物和抗性基因的增加和扩散，引起一系列污染和生态风险。作为21世纪一类新兴污染物，抗性基因的污染水平已经远远超过我们的预想。因此对人体、土壤等样本中抗性基因的分布水平、扩散传播及消减技术的研究，刻不容缓。微基生物可以提供抗性基因的定量检测服务。

 1 检测样本

粪便、水样、土壤、雾霾、细菌等 

若客户提供DNA，建议客户记录抽提DNA时样本的使用重量或是体积，方便后继对数据进行转化。

 2 检测平台

qPCR定量检测平台，能够检测300多种抗生素抗性基因。

 3 检测服务

绝对定量检测服务：
是测定目的基因在样本中的分子数目，通过构建标准曲线对未知模板进行分子数目的定量，即通常所说的拷贝数。

相对定量检测：
测定目的基因在样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的绝对拷贝数，一般是通过CT值之差来计算。

 4 检测方法

SYBRGreenⅠ法：

嵌入到双链DNA分子后在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后构象发生变化，能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光；而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

TaqMan探针法：

扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步

 5 qPCR的实验流程

 6 部分基因列表如下：

Gene	Classification	Mechanism
catA1、catB3、cfr等	(flor)/(chlor)/(am)phenicol	deactivate
cmlA1、cmx(A)、floR等		efflux
qnrA等		unknown
aac、aacA/aphD、aacC、aacC1、aacC2、aacC4、aadA、aadD、aadE、aph、aph6ia、aphA1(akakanR)、spcN-01、spcN-02、str、strA、strB等	Aminoglycosides	deactivate
ampC/blaDHA、ampC、bla1、blaCMY、blaCTX、blaGES、bla-L1、blaMOX/blaCMY、blaOCH、blaOKP、blaOXA1/blaOXA30、blaOXY、blaPAO、blaPER、blaPSE、blaROB、blaSFO、blaSHV-01、blaTEM、blaTLA、blaVEB、blaVIM、blaZ、cepA、cfiA、cfxA、cphA、fox5、NDM1、ampC等	Beta_Lactamas	deactivate
mecA、pbp、pbp2x、Pbp5、penA等	Beta_Lactamas	protection
int等	MGEs	integrase
IS613、tnpA、Tp614等		transposase
ereB、lnuA、lnuB、lnuC、mphA、mphB、mphC、vatB、vatC、vatE、vgb、vgbB等	MLSB	deactivate
carB、ImrA、matA/mel、mdtA、mefA、msrC、oleC、vgaA、vgbB、msrA等		efflux
erm、ermA、ermA/ermTR、ermB、ermC、ermF、ermJ/ermD、ermK、ermT、ermX、ermY等		protection
acrA、adeA、acrF、ceoA、cmeA、cmr、marR、mdetl1、mdtE/yhiU、mepA、mexA、mexD、mexE、mexF、mtrC、mtrD、oprD、oprJ、pmrA、qac、qacA、qacA/qacB、qacH、rarD、sdeB、tolC、ttgB、yceE/mdtG、yceL/mdtH、yidY/mdtL、ttgA、emrD等	Multidrug	efflux
fabK、bacA、bacA、fosB、fosX、sat4等	other	deactivate
imiR、nisB等		unknown
dfrA、folA等	Sulfonamides	deactivate
sul等		protection
tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetJ、tetK、tetL、tetPA、tet、tetV等	Tetracyclines	efflux
tet(32)、tet(36)、tet(36)、tetM、tetO、tetW、tetPB、tetS、tetT、tetQ等		protection
tet(34)、tet(37)、tetU-01、tetX、tet(35)等		unknown
vanA、vanB、vanC、vanG、vanHB、vanHD、vanRA、vanRB、vanRC、vanRD、vanSA、vanSB、vanSC、vanTC、vanTE、vanTG、vanWB、vanWG、vanXA、vanXB、vanXD、vanYB、vanYD等	Vancomycin	protection

 7 qPCR检测送样要求

	样本类型	样品量/例	备注
环境	土壤/沉积物/淤泥	1g
	湖水/海水/河水	1L，用滤膜或离心富集	过 0.22μm 的滤膜，或者 12000rpm 离心，进行富集。
	污水	20ml	若样本清亮则可适当地多取。
	泥水混合样	2ml
	空气	根据实验需要，用无菌滤膜过滤空气。
	发酵物	固体 2g，液体 20ml

	样本类型	样品量/例	备注
人体	粪便	≥3g
	皮肤	5 个采集拭子	采集 5cm*5cm 面积，反复刮取 20 次。
	生殖道	5 个采集拭子	采集阴道口内 4cm 处分泌物， 每个拭子转 3 圈。
	牙菌斑/舌苔	5 个采集拭子	在采集的部位，刮取 10 次左右。
	唾液	10ml
	痰液	10ml 或 2-3 口痰液
	鼻腔	5 个采集拭子	采集鼻腔内粘膜上的分泌物，转 3 圈。
	肺部灌洗液	30ml 富集液	对灌洗液进行离心富集。
	肠道/胃组织	5mm*5mm*3mm 3 块	尽量多一取些。
	血液	3ml 全血	用 EDTA 抗凝管，颠倒 8-10 次。 不建议用肝素。
	尿液	30mL 尿液	取中段尿为宜。
	母乳	5mL
动物	粪便	≥3g	最少 0.05g。
	盲肠/结肠/胃 组织	≥3g	至少 1g，如果实验条件允许，尽可能多的收集样本
	肠道内容物	≥3g	最少 0.05g。建议客户自己取内容物，可以用 PBS 冲洗。

提醒

1 因为qPCR绝对定量最终得到的是单位重量，或是单位体积目标基因的拷贝数，所以如果客户送DNA，建议客户记录抽提DNA时样本的使用重量或是体积，方便后继对数据进行转化。

2 送样时请尽量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保证运输过程中的低温条件（干冰的挥发消耗量约为 3-4 公斤/天）。在打包时放入足量的干冰， 将样本埋入干冰中， 为了保持冰盒中的低温环境，建议采用加厚的泡沫盒

 8 qPCR结果展示

标准曲线

扩增曲线

熔解曲线

定量结果

微基编号	拷贝数	样本稀释倍数	抽提样本重量（g）	基因组DNA体积（μL）	原始样本目标基因拷贝数copies/μL DNA	原始样本目标基因平均拷贝数copies/μL DNA	原始样本目标基因拷贝数copies/g样本	原始样本目标基因平均拷贝数copies/g样本
1	1.08E+06	200	0.237	50	2.17E+08	2.26E+08	4.58E+10	4.76E+10
1	1.23E+06	200	0.237	50	2.47E+08		5.20E+10
1	1.07E+06	200	0.237	50	2.14E+08		4.51E+10
2	7.28E+05	200	0.24	50	1.46E+08	1.49E+08	3.03E+10	3.09E+10
2	7.55E+05	200	0.24	50	1.51E+08		3.15E+10
2	7.44E+05	200	0.24	50	1.49E+08		3.10E+10
3	1.24E+06	200	0.25	50	2.48E+08	2.59E+08	4.96E+10	5.19E+10
3	1.35E+06	200	0.25	50	2.69E+08		5.39E+10
3	1.30E+06	200	0.25	50	2.61E+08		5.21E+10
4	1.61E+06	200	0.234	50	3.21E+08	3.22E+08	6.87E+10	6.87E+10
4	1.60E+06	200	0.234	50	3.19E+08		6.82E+10
4	1.62E+06	200	0.234	50	3.24E+08		6.93E+10
5	1.27E+05	200	0.175	50	2.54E+07	2.66E+07	7.25E+09	7.59E+09
5	1.33E+05	200	0.175	50	2.66E+07		7.61E+09
5	1.39E+05	200	0.175	50	2.77E+07		7.91E+09

 9 参考文献

1ujin gDuan et.al. Gut resistomes, microbiota and antibiotic residues in Chinese patients undergoing antibiotic administration and healthyindividuals.2020. Science of the Total Environment.（研究中国健康人和患者）
抗生素浓度与ARG总丰度呈正相关，与ARG总丰度呈负相关ARGs和细菌群落的多样性，这表明抗生素的使用可以形成抗生素耐药性和肠道细菌群落。cfxA基因作为一种潜在的生物标志物，以区分在中国广泛接受抗生素治疗的患者和健康的个人在患者的肠道中检测并显著富集。

2JieFenget.al.Antibiotic Resistome in alarge-scale healthy human gut microbiota deciphered by metagenomic and network analyses.2017.Environmental microbiology.（不同国家的肠道微生物抗性基因分析）
中国人的肠道样本中ermF、ermB、cfxA、tetQ的显著富集，高于瑞典，可作为中国人中潜在的生物标志物。