特定种类微生物检测

 1 检测对象

关于特定种类的微生物,客户可告知物种信息及引物信息,微基生物针对目标微生物进行qPCR定量分析;也可告知感兴趣的物种名称,微基生物来查询相关引物信息;如老师感性的物种信息尚未见文献报道,微基生物可以开发程序,自行研发寻找目标菌株的特异基因并设计目标菌株的特异引物,验证引物的特异性,进行后继实验。
微基生物已检测过的物种信息,见表格(仅列出了常见的部分微生物种类),其他的微生物也可以检测。

级别 中文名称 英文名称
细菌 Bacteria
真菌 Fungi
古菌 Archaea
放线菌门 Actinobacteria
拟杆菌门 Bacteroidetes
厚壁菌门 Firmicutes
alpha变形菌纲 Alpha-proteobacteria
gamma变形菌纲 Gamma-proteobacteria
肠杆菌科 Enterobacteriaceae
瘤胃球菌科 Ruminococcaceae
双歧杆菌属 Bifidobacterium
大肠杆菌属 Escherichia
乳酸杆菌属 Lactobacillus
梭菌属 Clostridium
肠球菌属 Enterococcus
拟杆菌属 Bacteroides
奇异菌属 Atopobium cluster 
链球菌属 Streptococcus 
瘤胃球菌属  Ruminococcus
粪杆菌属 Faecalibacterium
布劳特菌属 Blautia
艰难梭菌属 Clostridium difficile
脱硫弧菌属 Desulfovibrio
另支菌属 Alistipes
链球菌属 Streptococcus
萨特氏菌属 Sutterella 
丙酸杆菌属 Propionibacterium
假单胞菌属 Pseudomonas
噬酸菌属 Acidovorax
不动杆菌属 Acinetobacter
鞘氨醇单胞菌属 Sphingomonas 
分枝杆菌属 Mycobacterium
普氏菌属 Prevotella
溶纤维丁酸弧菌 Butyrivibrio fibrisolvens
蛋白溶解梭菌 Clostridium proteoclasticum
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus
青春双歧杆菌 Bifidobacterium adolescentis
鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus
粪肠球菌 Enterococcus faecalis
呀卟啉单胞菌 Porphyromonas gingivalis  
阴道加德纳菌 Gardnerella vaginalis
鼠乳杆菌 Lactobacillus murinus 
解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens 
芽孢杆菌 Bacillus velezensis
Akkermansia muciniphila
酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 
唾液链球菌 K12 Saliva streptococcs

 2 qPCR的原理

实时荧光定量PCR技术(Real-timeQuantitativePCR,qPCR)是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最终通过相对定量(与内参基因对比)或绝对定量(通过标准曲线对未知模板进行定量)的方法确定各个样本的本底表达量。

 3 3种荧光试剂的工作原理及区别

SYBRGreenⅠ法:

嵌入到双链DNA分子后在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后构象发生变化,能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光;而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

2 SYBRGreen工作原理图

TaqMan探针法:

扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5′-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步

3 Tanqman探针工作原理图

 SYBRGREEN法和TaqMan探针法的区别

方法 优点 缺点
SYBR
GREEN
高灵敏度,操作简单,不影响酶促反应,价格便宜 1与探针法相比,对引物特异性要求较高,需进行熔解曲线分析
2灵敏度相对较低。
TaqMan
探针法
1具有高度特异性
2更高的灵敏度
3可同时检测几种不同的荧光信号的产物
1探针价格较高
2需要不同引物的扩增效率一致,对引物的设计及扩增条件要求比较高

 4 qPCR的实验方法

实验方法 原理 技术应用 相关应用
绝对定量(AbsoluteQuantificationAQ) 是测定目的基因在样本中的分子数目,通过构建标准曲线对未知模板进行分子数目的定量,即通常所说的拷贝数。 特定微生物的拷贝数检测
特定功能基因的拷贝数检测
特定抗性基因的拷贝数检测
1临床疾病诊断
2动物疾病检测
3食品安全
4科学研究
5应用行业:各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
相对定量(RelativeQuantificationRQ) 测定目的基因在样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的绝对拷贝数,一般是通过CT值之差来计算。 样本中某种特定微生物拷贝数占全部微生物拷贝数的比例
某种功能基因的微生物拷贝数占全部微生物拷贝数的比例
某种抗性基因拷贝数占全部微生物拷贝数的比例

 相对定量和绝对定量的数据计算方法

标准质粒拷贝数计算:

每微升拷贝数(copies/μl)=[质粒浓度(ng/ul)×10-9×6.02×1023]/克隆产物相对分子质量
原始样本目标基因拷贝数copies/μLDNA=拷贝数*稀释倍数
原始样本目标基因拷贝数copies/g样本=(原始样本目标基因拷贝数copies/μLDNA*基因组DNA体积)/样本抽提重量,(如果客户样本为DNA样本,则不需要计算copies/g样本)

相对定量的计算:

步骤1:内参基因均一化样本差异:Ct目的基因–Ct内参基因=△Ct

步骤2:其他样本和对照样本比较:△Ct处理样本–△Ct对照样本=△△Ct

步骤3:使用公式计算:倍数变化=2-△△Ct

 5 qPCR的实验流程

6 qPCR实验流程图

 6 qPCR检测送样要求

样本类型  样品量/例  备注
环境 土壤/沉积物/淤泥  1g
湖水/海水/河水  1L,用滤膜或离心富集   0.22μm 的滤膜,或者 12000rpm 离心,进行富集。
污水  20ml  若样本清亮则可适当地多取。
泥水混合样  2ml
空气  根据实验需要,用无菌滤膜过滤空气。
发酵物  固体 2g,液体 20ml

样本类型  样品量/例  备注
人体 粪便  3g
皮肤  5 个采集拭子  采集 5cm*5cm 面积,反复刮取 20 次。
生殖道  5 个采集拭子  采集阴道口内 4cm 处分泌物, 每个拭子转 3 圈。
牙菌斑/舌苔  5 个采集拭子  在采集的部位,刮取 10 次左右。
唾液  10ml
痰液  10ml  2-3 口痰液
鼻腔  5 个采集拭子  采集鼻腔内粘膜上的分泌物,转 3 圈。
肺部灌洗液  30ml 富集液  对灌洗液进行离心富集。
肠道/胃组织  5mm*5mm*3mm
3 
 
尽量多一取些。
血液  3ml 全血   EDTA 抗凝管,颠倒 8-10 次。 不建议用肝素。
尿液  30mL 尿液  取中段尿为宜。
母乳  5mL
动物 粪便  3g  最少 0.05g
盲肠/结肠/
组织
 
3g  至少 1g,如果实验条件允许,尽可能多的收集样本
肠道内容物  3g  最少 0.05g。建议客户自己取内容物,可以用 PBS 冲洗。

提醒

1 因为qPCR绝对定量最终得到的是单位重量,或是单位体积目标基因的拷贝数,所以如果客户送DNA,建议客户记录抽提DNA时样本的使用重量或是体积,方便后继对数据进行转化。

2 送样时请尽量使用冰盒(泡沫盒+干冰),以保证运输过程中的低温条件(干冰的挥发消耗量约为 3-4 公斤/天)。在打包时放入足量的干冰, 将样本埋入干冰中, 为了保持冰盒中的低温环境,建议采用加厚的泡沫盒

 7 qPCR结果

标准曲线

9 标准曲线

扩增曲线

10 扩增曲线

熔解曲线

11 熔解曲线

定量结果

微基编号 拷贝数 样本稀释倍数 抽提样本重量(g) 基因组DNA体积(μL) 原始样本目标基因拷贝数copies/μL DNA 原始样本目标基因平均拷贝数copies/μL DNA 原始样本目标基因拷贝数copies/g样本 原始样本目标基因平均拷贝数copies/g样本
1 1.08E+06 200 0.237 50 2.17E+08 2.26E+08 4.58E+10 4.76E+10
1 1.23E+06 200 0.237 50 2.47E+08 5.20E+10
1 1.07E+06 200 0.237 50 2.14E+08 4.51E+10
2 7.28E+05 200 0.24 50 1.46E+08 1.49E+08 3.03E+10 3.09E+10
2 7.55E+05 200 0.24 50 1.51E+08 3.15E+10
2 7.44E+05 200 0.24 50 1.49E+08 3.10E+10
3 1.24E+06 200 0.25 50 2.48E+08 2.59E+08 4.96E+10 5.19E+10
3 1.35E+06 200 0.25 50 2.69E+08 5.39E+10
3 1.30E+06 200 0.25 50 2.61E+08 5.21E+10
4 1.61E+06 200 0.234 50 3.21E+08 3.22E+08 6.87E+10 6.87E+10
4 1.60E+06 200 0.234 50 3.19E+08 6.82E+10
4 1.62E+06 200 0.234 50 3.24E+08 6.93E+10
5 1.27E+05 200 0.175 50 2.54E+07 2.66E+07 7.25E+09 7.59E+09
5 1.33E+05 200 0.175 50 2.66E+07 7.61E+09
5 1.39E+05 200 0.175 50 2.77E+07 7.91E+09

 8 术语解释

Ct值(Cyclethreshold,循环阈值):每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
荧光阈值(threshold)的设定:PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光阈值的缺省(默认)设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即:threshold=10*SDcycle3-15
基线(baseline):在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,即称为基线。
熔解曲线Tm(TmOfMeltingCurve):SYBRGreen染料发实验结束后需对qPCR产物加热,随着温度的升高,双链接扩增产物逐渐解链,导致荧光强度下降,到达某一温度时,会导致大量的产物解链,荧光急剧下降,将此温度称为Tm值。不同PCR产物Tm值不同,从而可对PCR的特异性进行鉴定。

 9 参考文献

1 Tristano Bacchetti De Gregoris et.al. Improvement of phylum- and class-specific primers for real-time PCR quantification of bacterial taxa.2011. Journal of Microbiological Methods.(厚壁菌门拟杆菌门alpha变形菌gamma变形菌等)

2 Baskar Balakrishnan et.al. Development of a real-time PCR method for quantification of Prevotella histicola from the gut.2017.Anaerobe.(普氏菌)

3 John Penders et.al. Quantification of Bifidobacterium spp., Escherichia coli and Clostridium difficile in faecal samples of breast-fed and formula-fed infants by real-time PCR.2005. FEMS Microbiology Letters.(双歧杆菌艰难梭菌大肠杆菌探针法)

4 Anders Bergstrom et.al. Introducing GUt Low-Density Array (GULDA) – a validated approach for qPCR-based intestinal microbial community analysis.2012. FEMS Microbiology Letters.(多种菌的定量)