土壤微生物多样性分析 soil microbial diversity

 

土壤微生物多样性分析  soil microbial diversity 

土壤是微生物生长和繁殖的天然培养基。土壤微生物之间相互依赖、彼此制约，同时又与周围的环境因子相互作用、往复调控。自然或干扰条件下土壤微生物的群落结构、种群消长、生理代谢、遗传变异及其演替有一定的规律，因此土壤微生物多样性研究对于探索自然生命机制、开发超常生物资源、应对全球气候变化、治理各类环境污染、维持生态服务功能及促进土壤持续利用等方面具有重要意义。
基于16S/18S/ITS序列扩增，根据客户需求采用不同测序平台（Roche 454和 Illumina），利用NGS高通量测序技术，获得庞大的数据信息，通过现代生物信息学手段，获得微生物总体群落，并通过RDA，CCA，NMDS分析，找到环境因子（pH，C/N，湿度，总氮，总磷，TOC，含水量等）与微生物群落组成的相关性，进而分析微生物与环境的相互关系。

研究现状

1、 Congcong Shen等对长白山不同海拔高度，分布有不同植被的土壤微生物进行分析，研究菌落组成的差异及这种差异产生的影响因素与微生物群落之间的相互关系。得到结论，pH能更好的预测不同海拔高度细菌分布，植被类型可能通过改变C/N来间接影响不同海拔高度细菌的分布情况。

Soil pH drives the spatial distribution of bacterial communities along elevation onChangbai Mountain
Congcong Shen, Jinbo Xiong, Huayong Zhang, Youzhi Feng, Xiangui Lin,Xinyu Li,Wenju Liang, Haiyan Chu
Soil Biology & Biochemistry 57 (2013) 204e211

样本质量：0.5g土壤

土壤样本基因组DNA抽提试剂盒：FastDNA

SPIN Kit for soil (MP Biomedicals, Santa Ana, CA)

分析区域：16S rRNA V4-V5高变区

测序平台使用：Roche FLX 454 pyrosequencing

主要结论：

（1）不同样本微生物在门的水平上的群落结构分析

（2）不同海拔高度微生物群落的CCA（Canonical correspondence analysis）分析，得到不同海拔高度样本中微生物群落受环境因子（土壤pH、海拔高度、碳氮比、总有机碳、降雨量）影响的差异。

（3）主要微生物群落的相对丰度与不同海拔高度土壤pH之间的相互关系。

2、 Sizhong Yang等研究沿中俄原油管的永冻层土壤中细菌的群落分析。

Pyrosequencing Investigation into the Bacterial Community in Permafrost Soils along the China-Russia Crude Oil Pipeline (CRCOP)
Sizhong Yang, Xi Wen, Huijun Jin, Qingbai Wu
plos one,December 2012 | Volume 7 | Issue 12 | e52730

土壤样本基因组DNA抽提试剂盒：Power Soil DNA Isolation Kit (MOBIO, USA)

16S rRNA分析区域：V1-V3高变区

测序平台：Roche FLX 454

主要结论：

（1）Rarefaction Curve：不同样本稀释曲线分析取样深度是否合理。

（2）群落结构分析：不同样本在门的水平上细菌群落的组成分析

 

（3）Heatmap：细菌在目得水平上，12个样本中前100个目得细菌菌落分布分析。

（4）PCA分析和NMDS分析：PCA分析显示不同位点的微生物群落组成不同。NMDS分析表明上面冻融层土壤的微生物群落在某种程度上与环境参数总有机碳、总氮、总磷、含水量相关。

（5）VEEN图：分别分析Upper active layer（1300，2300，3300 和 4300）、Lower active layer（1500，2500，3500 和4500)、Permafrost table （1600，2600，3600和4600）样本中OTU的相似性。

我们的分析内容：

技术路线

 

项目分析内容

1 基因组抽提电泳检测图：
2 设计并合成引物
3 PCR产物定量及均一化
4 高通量测序
5 生物信息学分析
(1)根据barcode将大量的测序结果回归样本
(2)通过严密准确的程序，统计测序结果中的最终优化序列
(3)OUT（Operational Taxonomic Units）分布统计
(4)菌群多样性、丰度和测序深度指数计算及shannon指数曲线绘制
(5) 稀释曲线（Rarefaction curve）：检测样品的取样深度情况
(6)OTU分类学综合信息表
(7)样品OUT分布的比较–VEEN图：统计多个样品中所共有的 OTU 数目可以反映环境样品的相似性及重叠情况
(8) 多样品相似度比较
(9)微生物群落结构分析
(10) PCA（Principal component analysis）：反映不同样品中微生物群落组成的相似性以及影响微生物多样性的主要因素
(11) PCoA (principal coordinate analysis)
(12) RDA（Redundancy analysis）：使用RDA分析，可进行与环境因子相关的微生物的筛选
(13) CCA（Canonical correspondence analysis）：使用CCA分析微生物群落与环境因子的相互关系
(14) NMDS（Nonmetric Multidimensional Scaling）

送样要求

送样类型1
(1)样品类型：新鲜土壤，冻存于-80℃
(2)样品需求：≥3g
(3)样品保存期间切忌反复冻融，送样时请使用冰袋或干冰运输
(4)对于本种类型的样品，一般采用MOBIO PowerSoil DNA Isolation Kit进行基因组DNA抽提，根据样本不同采取最佳抽提方法
送样类型 2
(1) 样品类型： DNA
(2) 样品需求量：≥300ng
(3) 样品浓度： ≥10ng/μL
(4) 样品纯度：OD260/280=1.8-2.0并确保DNA无降解
(5) 样品保存期间切忌反复冻融，送样时请使用冰袋或干冰运输
(6) 对于本种类型的样品，我们在检测完样品的质量后，进行PCR扩增等后续试验。