肠道菌群多样性分析 intestinal microbial diversity

肠道菌群多样性分析 intestinal microbial diversity 

肠道中存在种类繁多的微生物，肠道菌群失调与多种疾病如结直肠癌、腹泻、炎症性肠炎，乃至慢性代谢性疾病如肥胖、糖尿病等的发生发展都有直接或间接的关系。维持肠道菌群结构和功能的健康平衡状态，对于人体健康具有重大的意义。随着现代分子生物技术的蓬勃发展，已解决了不可培养微生物研究的难题，使得肠道微生物的研究进入一个新的阶段，NGS高通量测序技术的发展，使得研究者可以基于16S/18S/ITS序列的扩增，获得庞大的数据信息，通过生物信息学手段，对大量数据进行PCA和PCoA分析，得出发病前后样本间肠道微生物主要组成成分是否存在差异；并进一步通过RDA分析，找到与环境因子（疾病等）相关的微生物群落组成。

研究现状

1、Tingting Wang等采用454测序技术研究结直肠癌（CRC）患者与正常人群肠道微生物的菌落组成差异。并结合real-time PCR对相关基因进行分析，最终确定丁酸盐产生菌的减少和一些致病微生物的增加使得CRC患者肠道微生物菌落的失衡。

Structural segregation of gut microbiota between colorectal cancer patients and healthy volunteers Tingting Wang, Guoxiang Cai, Yunping Qiu, Na Fei, Menghui Zhang, Xiaoyan Pang,Wei Jia, Sanjun Cai and Liping Zhao The ISME Journal (2012) 6,320–329

研究对象：CRC患者46人，健康人群56人

主要结论：

（1）PCA主成分分析（图a）和PCoA主坐标分析（图b）显示CRC患者与正常人肠道微生物存在差异。蓝色圆圈代表正常人，红色圆圈代表CRC患者

（2）对CRC患者与正常人样本在98%相似水平上OTU的相对丰度进行RDA分析，找到健康人群与CRC疾病患者相关的微生物类群，进行分析与CRC疾病相关的主要微生物类群。有48个OTU可以作一个关键变量与CRC患者和正常人肠道微生物结构差异存在显著相关性。

（3）Heatmap分析：48个OTU的相对丰度作为健康人和CRC患者肠道微生物差异的主要变量，他们在样本中的分布情况见下图。图左侧黑色OTU代表在正常人中相对丰富，红色OTU代表在CRC患者中相对丰富，每个样本的颜色强度代表在所有样本中的相对比率。

2、Larsen等研究二型糖尿病患者肠道微生物与非糖尿病人群的差异，采用454测序技术结合qPCR技术对36个样本肠道微生物进行分析，结果表明二型糖尿病患者厚壁菌门和唆菌纲微生物比例较对照组显著降低，但是变形菌纲微生物丰富。Bacteroidetes与Firmicutes的比例、Bacteroides-Prevotella group 与 C. coccoides-E. rectale group的比例与血糖浓度呈正相关，而与BMI（体重系数）无关。变形菌纲微生物同样与血糖浓度呈正相关。

Gut Microbiota in Human Adults with Type 2 Diabetes Differs from Non-Diabetic Adults Nadja Larsen,Finn K. Vogensen, Frans W. J. van den Berg,Dennis Sandris Nielsen,Anne Sofie Andreasen,Bente K. Pedersen,Waleed Abu Al-Soud,Søren J. Sørensen,Lars H. Hansen,Mogens Jakobsen plos one,February 2010 | Volume 5 | Issue 2 | e9085

研究对象：二型糖尿病患者18人，正常人18人

主要结论：

（1）Rarefaction Curve：确定取样深度是否合理。

(2)PCA主成分分析：分析二型糖尿病患者与正常人肠道微生物在门与纲水平的差异。

我们的分析内容：
技术路线

项目内容

1 基因组抽提电泳检测图：

2 设计并合成引物
根据测序需求，设计16S和18S的最适宜引物，添加引物接头，通过软件分析检测引物的可用性。 16S引物设计简要图

18S引物设计简要图

3 高通量测序
根据客户的需求，采用不同的测序平台进行高通量测序，Roche 454高通量测序平台、Illumina HiSeq 2500高通量测序平台、MiSeq 高通量测序平台等。
4 生物信息学分析
(1)根据barcode将大量的测序结果回归样本
(2)通过严密准确的程序，统计测序结果中的最终优化序列
(3)OUT（Operational Taxonomic Units）分布统计
(4)菌群多样性、丰度和测序深度指数计算及shannon指数曲线绘制

(5) 稀释曲线（Rarefaction curve）：检测样品的取样深度情况

(6)OTU分类学综合信息表

 

(7)样品OUT分布的比较–VEEN图：统计多个样品中所共有的 OTU 数目可以反映环境样品的相似性及重叠情况

 

(8) 多样品相似度比较

(9)微生物群落结构分析

(10) PCA（Principal component analysis）：反映不同样品中微生物群落组成的相似性以及影响微生物多样性的主要因素

(11) PCoA (principal coordinate analysis)

(12) RDA（Redundancy analysis）：使用RDA分析，可进行与环境因子相关的微生物的筛选

送样要求
送样类型1
(1)样品类型：粪便，新鲜取样，冻存于-80℃
(2)样品需求：≥2g
(3)样品保存期间切忌反复冻融，送样时请使用冰袋或干冰运输
(4)对于本种类型的样品，我们将采用Qiagen QlAamp DNA tool Mini Kit进行基因组DNA抽提
送样类型 2
(1) 样品类型： DNA
(2) 样品需求量：≥300ng
(3) 样品浓度： ≥10ng/μL
(4) 样品纯度：OD260/280=1.8-2.0并确保DNA无降解
(5) 样品保存期间切忌反复冻融，送样时请使用冰袋或干冰运输
(6) 对于本种类型的样品，我们在检测完样品的质量后，进行PCR扩增等后续试验。