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实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

real-time

原理
  在PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号累计实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
特点
  检测仪器少,只用一台仪器。
  检测时间短,只须45分钟~1小时10分钟(试剂各异),而定性PCR须3~4小时,酶免终点定量须6~8小时,荧光终点定量须2~3小时。
  操作极其简单:前处理后,样本插入仪器一小时后到电脑上来出报告即可,无须开盖,移样本(以前方法),避免污染。
  结果精确:定性PCR只能定性,很粗略,终点定量PCR由于只能在40个热循环结束后检测荧光,被测荧光达到饱和导致定量不够精确,属于半定量状态。而实时荧光QPCR是在扩增的每时每刻连续检测各样本的荧光值的变化。
应用
  基因扩增、检测、定量分析; 扩增特异性分析;SNP分析;RFLP多态性分析;单/多基因表达研究;高通量基因表达谱研究。

微基生物其QPCR定量实验流程:
1. 标准曲线的制作
  标准曲线利用含有qPCR目的片段的质粒为标准基因,具体步骤如下:
  (1) 选用克隆文库中含有目标基因质粒的摇瓶培养;

根据客户需求,构建标准质粒(16S/18S/ITS/功能基因)

  (2)试剂盒提取质粒;
  (3)测定质粒浓度;
  (4)对质粒的拷贝数进行计算;
  (5)将质粒DNA进行10倍梯度系列稀释制作标准样品和待测样品一起扩增,得出标准曲线;
  (6)根据所得标准曲线计算出样品中的基因拷贝数,最后以基因拷贝数每μL为单位进行分析。
2、荧光定量
  (1)本研究通过荧光定量的方法细菌16S rRNA基因进行定量。引物选取->qPCR。

根据客户需求设计的引物进行实验

  (2)PCR扩增程序1
3、标准曲线绘制
4、样品中拷贝数测定