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口腔微生物

口腔是人体微生物定植生存的重要生态区,口腔微生物不仅有细菌,还包括真菌、病毒、螺旋体及古细菌等。口腔内环境稳态易受外界因素的干扰,口腔内部有多位点、多层次的微生物定植生态区,口腔环境的异质性较肠道更为明显。正常情况下口腔微生物群落之间、微生物与宿主之间密切且复杂的相互作用维持着宿主健康,这种生态平衡被打破将会引发疾病。口腔主要疾病如龋病、牙周病及口腔癌等严重影响人类的生命健康。

基于16S rDNA/18S rDNA基因,优化实验方法,增加对痕量微生物的研究,利用二代测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术(454 GS FLX,Illimina HiSeq、MiSeq)来分析口腔微生物的多样性,得到对微生物多样性、群落结构、种系关系精确的解析,增加人们对口腔健康与疾病相关微生物的认识。

研究案例:

1 口腔不同部位的微生物组

Zaura等基于对3个健康个体口腔牙面、颊、硬腭、舌、唾液5个部位的微生物组进行了测序分析,发现牙齿邻面微生物多样性最高,颊部微生物多样性最低,PCA可以区分牙表面和软组织表面的微生物群落。3个个体的微生物组构成有较大的重叠,1660个序列(占66%测序内容)在3个个体间共同存在。

Defining the healthy “core microbiome” of oral microbial communities.2009.BMC Microbiology.

研究区域:16S rDNA V5-V6区域
测序平台:Roche 454 GS FLX

主要结论:
(1)Veen图说明3个个体口腔不同部位微生物在不同聚类程度下的重叠情况,研究表明,在不同聚类程度下,3个个体的微生物组构成有较大的重叠。

oral-microorganisms-venn

(2)左图为3个个体口腔公有微生物的相对丰度,不同颜色代表不同个体;右图为在门的分类水平上,每个个体口腔不同位点微生物的相对分布情况。

relative abundance

(3)PCA分析口腔不同部位微生物的差异情况,如图可见,PCA可以区分牙表面和软组织表面的微生物群落。

PCA2

2口腔真菌微生物研究

Ghannoum等应用ITS引物首次鉴定了人类口腔的基本真菌组。健康人的口腔中共检测出74种已培养的真菌属和11种尚未培养的真菌属。假丝酵母菌检出率最高,接下来依次是枝孢菌、酵母菌、短梗霉、黄曲霉、镰孢菌、隐球菌属,其中4种是已知的人体致病菌。

Characterization of the Oral Fungal Microbiome (Mycobiome) in Healthy Individual. 2010. PLoS pathogens.

研究区域:ITS1
测序平台:Roche 454 GS FLX

主要结果
(1)样本中各物种相对丰度统计图

relative abundance2

(2)PCoA分析不同样本之前物种的相似情况。

PCoA

3龋病与口腔微生物研究

Belda-Ferre等测序了2个无龋个体、2个轻度龋个体、2个重度龋个体的龈上菌斑,发现龋病的优势菌并不是变异链球菌,而是由数十个菌种构成的复杂群落。致龋微生物组和正常微生物组在群落结构和基因功能上有显著的鉴别特征,可以作为龋病防治的生物标记;未患龋个体的微生物组是龋病防治的基因资源库,从中可以寻找有效的抗菌肽和益生菌作为新型的抗龋药物。

The oral metagenome in health and disease. 2012. The ISME Journal.

研究区域:宏基因组
测序平台:Roche 454 GS FLX

主要结果:
(1)左图的Heatmap显示口腔中细菌相对丰度及多样性;右图基于COG功能分类系统,每个分类组对编码潜在生态系统的相对贡献。

Heatmap

(2)口腔和成人肠道样本中微生物宏基因组的功能模式图。分类是基于MG-RAST的子系统第二个级别。

4牙周病与口腔微生物

人类口腔中存在大量的微生物,构成一个复杂的生态系统。口腔内病原菌的扩散会引起牙周病,炎症性疾病也是引起心血管疾病的一个危险因素。Liu等人对牙周炎患者和健康人的龈下斑样本的16S rDNA及全基因组进行Roche 454 GS FLX二代测序分析,发现存在一种未培养的TM7物种,牙周炎患者的口腔微生物群落结构与健康人存在差异,说明在疾病状态下,口腔微生物的结构分布会有一定程度的改变。

Deep Sequencing of the Oral Microbiome Reveals Signatures of Periodontal Disease. 2012. PLoS One.

研究区域:V1-V2区
测序平台:Roche 454 GS FLX

主要结果:
(1) 通过Heatmap分析Genus水平不同样本中各物种的相对丰度。

Genus-Heatmap

(2)示意图展示由于生活方式改变,导致牙齿和牙龈组织周围相关微生物发生改变,从而使健康的牙齿向牙周炎恶化。
(3)Actinomyces naeslundiiMG1的参考基因组和样本H1、H2的对比分析。

Actinomyces naeslundiiMG1

5口腔癌与口腔微生物

Pushalkar等研究了3个口腔扁平细胞癌患者的唾液微生物组,共发现8个门的微生物,主要由厚壁菌门和拟杆菌门微生物组成。微生物多样性极为丰富,包括860个(33%)已知菌种,其中非培养或未归类的菌种占67%,还有15个独特种系型在各患者唾液内都存在,这说明口腔癌的发生伴随有口腔微生物组的结构改变,口腔微生物组有可能用于口腔癌的早期诊断。

Microbial diversity in saliva of oral squamous cell carcinoma. 2010. FEMS.

研究区域:V4-V5区
测序平台:Roche 454 GS FLX

主要结果:
通过VENN图分析不同样本中物种(common/unique)的重复情况:a是口腔癌患者之间;b是对照组之间;c是患者与对照之间。

Venn