2  血液微生物组样本采集方法与注意事项

2.1全血取样：研究血液微生物多样性的首选

全血样本可完整保留血浆、红细胞、白细胞等各组分中的微生物及其遗传物质，是全面分析血液微生物群落的核心选择。经优化检测流程处理后，微生物检出效率与红细胞层/血细胞层样本一致性达98%以上，且无需额外离心分层，操作简单，污染风险低。

2.1.1全血样本采样步骤

采样前准备：选择符合实验条件的受试者，告知实验相关信息并签署知情同意书；准备EDTA或肝素抗凝采血管、一次性采血针、无菌注射器、冰浴设备等，确保所有耗材无菌。

采集操作：采集2-5mL外周血于抗凝采血管中或进口离心管中（提前添加抗凝剂）。轻轻颠倒摇晃混匀（不可剧烈摇晃，以防溶血）。

2.2血液中不同组分的取样：针对性研究特定微生物群落

若需聚焦特定血液组分中的微生物，可采集全血后在实验室规范离心分层，再选取目标组分检测。建议先采集全血，再进行离心处理，既满足分层样本需求，又可保留全血样本以备复检或其他检测。

血浆：微生物含量极低（仅占0.03%），聚焦细胞游离微生物DNA（cfmDNA），适用于感染早期诊断、疾病相关微生物标志物筛选等研究。

Buffy 层（白细胞层）：微生物DNA含量最丰富，适用于高灵敏度微生物DNA检测，尤其适合研究胞内寄生微生物及极低丰度的微生物。

红细胞层：含少量微生物DNA，适合分析红细胞内寄生微生物，避免溶血影响核酸提取效率。

2.2.1分层样本采样步骤

采样前准备：与全血采样一致，需额外准备低温离心机、无菌离心管等设备。

全血采集：采集2-5mL外周血于抗凝采血管中或进口离心管中（提前添加抗凝剂），轻轻颠倒摇晃混匀（不可剧烈摇晃，以防溶血），4℃或冰浴静置约10min，先低温低速离心（3000rpm，10min，4℃），使血液分为血浆层（上层）、白细胞和血小板层（中层）、红细胞层（下层）。用无菌移液器或吸管分别吸取目标组分。

2.3注意事项

a）不要使用无抗凝剂的采血管（凝血后，微生物基因组提取变得非常困难）。

b）采血过程需等消毒剂（乙醇、异丙醇等）完全挥发后采样。

c）采集过程中，样品放置时间，离心时间、等保持一致。

d）红细胞/血细胞层得率约50%，1mL外周血可得约0.5mL血细胞层。

e) 样本按500μL/支分装，方便后继需要多次检测，尽量避免样本多次冻融。

f）血细胞层如发生溶血（冻存前或冻存后），只要不凝块，不影响微生物基因组DNA提取。

3  血液代谢组样本采集方法与注意事项

3.1 血浆样本代谢组检测 

3.1.1 采集步骤

采集2-5mL外周血于抗凝采血管中或进口离心管中（需提前添抗凝剂），轻轻颠倒摇晃混匀（不可剧烈摇晃，以防溶血），4℃或冰浴静置约10min，先低温低速离心（3000rpm， 10min，4℃），取大部分上层血浆，200μL分装到洁净螺口管中，液氮速冻15min（可省略）。

3.1.2注意事项

a) LC-MS平台推荐使用肝素钠/EDTA 抗凝，NMR平台推荐使用肝素钠抗凝；血浆样品不推荐使用柠檬酸做抗凝剂，因为柠檬酸是TCA循环中的重要物质，使用柠檬酸钠抗凝剂会引入外源污染。而EDTA会影响NMR采谱。需注意肝素钠会对RNA相关的实验有负面作用，主要是因为会抑制反转录酶活性。请根据实验需求选择合适抗凝管。

b）采血过程需等消毒剂（乙醇、异丙醇等）完全挥发后采样。

c）采集过程中，样品放置时间，离心时间等保持一致。

d）分装使用的离心管尽可能使用低吸附离心管。

e）血浆得率约50%，1mL外周血可得约0.5mL血浆。

f) 样本按200μL/支分装，是方便后继需要多次检测，应尽量避免样本多次冻融情况。

3.2血清样本代谢组检测

3.2.1 采集步骤

采集2-5mL外周血于无任何添加剂的采血管或进口离心管中，轻轻颠倒摇晃混匀（不可剧烈摇晃，以防溶血），4℃或冰浴静置约1h（确认凝集出血块），先低温低速离心（3000rpm，10min，4℃）；取大部分上层血清，将上述血清按200μL/支，分装至螺口管中，液氮速冻15min（可省略）。如血清量不够，可再次高速离心（12000rpm，10min，4℃），取剩余少量上层血清，如发生溶血，则不可再取/用。

3.2.2 注意事项

a）血清样品推荐使用无采任何添加剂的采血管（不用有促凝剂的采血管）。

b）采血过程需等消毒剂（乙醇、异丙醇等）完全挥发后采样。

c）采集过程中，样品放置时间，离心时间等保持一致。

d）血清得率约30-50%，1mL外周血可得约0.3-0.5mL血清。

e) 样本按200μL/支分装，是方便后继需要多次检测，应尽量避免样本多次冻融情况。

4 推荐采样量

5  样本的保存和寄送

短期保存（≤24小时）：采集后立即置于4℃冷藏保存，避免室温放置超过4小时。分层样本需单独密封保存，防止交叉污染，尤其血浆样本需避免与细胞组分接触导致游离DNA降解。

长期保存（>24 小时）：样本按对应分装标准分装入洁净螺口管，避免反复冻融。-80℃冰箱可保存6-12个月，-20℃冰箱可短期保存1-3个月。

特殊注意事项：

需保留微生物活性或进行微生物培养的样本，必须使用抗凝剂防止凝固，存放于室温或4℃冰箱，且需尽快开展后续实验，不宜长期存放。

冷冻后的全血样本解冻后，轻微溶血可正常检测；严重溶血（血液呈酱油色）需重新采集，避免血红蛋白干扰核酸提取。

若无法实现低温保存，可使用微基生物研发的微生物DNA常温采集保存套装，样本可在常温下稳定保存14天。 

6  附（抗凝管的种类和颜色）

提示：血液样本的代谢组学检测，采血管只接收红盖（无添加），绿盖（添加肝素钠），紫盖（添加EDTA）。禁用PAXgene管，添加促凝剂的红盖管等。

7 常见问题解答

1）全血样本与分层样本的检测结果有差异吗？

无显著差异，全血样本经优化检测流程后，微生物检出效率与红细胞层/血细胞层样本一致性达98%以上，不影响检测准确性。

2）忘记加抗凝剂的全血样本还能检测吗？

不可检测。未抗凝的血液会发生凝固，导致细胞裂解和微生物失活，严重影响检测结果。

3）全血样本可以检测哪些微生物？

适用于检测细菌、真菌、病毒、非典型病原体等多种微生物。全血mNGS技术可以同时检测数千种微生物，提高了检测的全面性。

4）采血量对检测结果有影响吗？

有影响，采血量直接影响检测的灵敏度。推荐按标准采血量采集，采血量不足会降低微生物检出率。

5）可以使用不同类型的抗凝剂吗？

推荐使用EDTA抗凝剂；肝素抗凝剂也可使用，但需注意其可能抑制某些PCR反应；不推荐使用枸橼酸钠抗凝剂。

6）可以检测到所有病原体吗？

目前没有任何一种方法可以检测到所有病原体。不同检测方法各有优劣，微基生物可根据您的临床需求选择合适方法，必要时联合多种方法提高检出率。

血液微生物组、代谢组检测样本采集说明，首发于微基生物。

目前微基生物已与中科院、北京大学、清华大学、长征医院、红房子医院等多所高校科研院所和三甲医院合作，已检测过人、小鼠、大鼠、猴子等多种动物的粪便及肠道内容物。微基生物可采用二代高通量测序、三代高通量测序、PCR-DGGE等方法，对样本中微生物的DNA进行测定，并通过生信统计分析，对大量数据进行处理，揭示肠道中微生物的种类以及它们之间的相对丰度和进化关系；还可以通过实时荧光定量PCR方法，定量的研究肠道菌群，探讨微生物多样性，研究肠道微生物与环境间的相关关系；还可以通过厌氧培养，获得肠道微生物中的菌种，从菌株水平上研究肠道微生物的功能和作用。

目前肠道微生物的主要研究方向：
（1）寻找疾病组和健康组间肠道菌群的差异：
分别采集健康人群和疾病人群的粪便样本，比较健康组和疾病组之间肠道菌群的差异，寻找与疾病相关的marker，这是目前最典型的研究方法；
（2）研究药物或饮食干预群体的肠道菌群：
分别采集药物或饮食干预前、后的群体的粪便样本，比较个体在不同干预阶段的肠道菌群的差异；
（3）同一群体、不同生长发育时期的肠道菌群：
如分别采集婴儿出生后0个月、4个月、12个月等时间的粪便样本，对婴幼儿的肠道菌群进行研究；
（4）研究某一疾病发生发展进程中的群体的肠道菌群：
如分别选择健康人、结直肠腺瘤患者（大部分的结直肠癌由腺瘤演变而来）、结直肠癌患者群体，研究与结直肠癌疾病进程相关的marker；
（5）研究同一群体多个身体部位的微生物：
如分别选取同一人群的粪便、唾液、牙菌斑等样本进行关联分析。

微基生物可以做什么：
（1）研究样本中微生物的种类及其对应的丰度；
（2）对样本中某一种微生物进行定量；
（3）通过厌氧培养获得样本中微生物的菌株。

微基生物提供肠道微生物多样性分析的整体科研服务：实验规划->样本采集保存->分子实验->生信统计分析->论文协助

已检测对象：
人、小鼠、大鼠、猴子、鸡、羊、鱼、马、驴、熊猫、穿山甲等动物的粪便或肠道内容物；

检测类型：
细菌、真菌、放线菌等；

检测方法：
二代高通量测序、三代高通量测序、PCR-DGGE、实时荧光定量PCR、厌氧培养；

检测平台：
（1）微基生物拥有Illumina MiSeq、Ion PGM高通量测序分析，PacBio第三代高通量测序分析，PCR-DGGE变性梯度凝胶分析，实时荧光定量PCR（Real-time qPCR），克隆文库等检测平台。
（2）具有厌氧培养系统，可以分离粪便样本中的微生物。

样本采集耗材：
为客户提供样本采集保存耗材，包括粪便采集盒、常温保存液、取样勺和保存管等。

样本采集方法：
（1）人粪便：采集新鲜的、中后段、内部的粪便样本，每个样本需1g，采好后立刻冻存于-80℃冰箱，保存期间切记反复冻融。
（2）小鼠粪便：建议采用拎尾法或者代谢笼采集新鲜粪便，每个样本需1g，采好后立刻冻存于-80℃冰箱，切记反复冻融。
（3）大鼠粪便：可采用代谢笼采集新鲜粪便样本，每个样本需1g，采好后立刻冻存于-80℃冰箱，切记反复冻融。
对于其他样本的采集，可咨询微基生物技术支持，400-660-9270.
若无法实现低温保存，可采用微基生物研发的常温采集保存套装，可在常温下保存14天。

送样要求：
（1）粪便样本或肠道内容物样本：每样本需1g，新鲜取样，冻存于-80℃，保存期间切忌反复冻融，送样时请使用冰袋或干冰运输；
（2）DNA样本：DNA总量≥300ng，浓度≥10ng/μL，OD260/280=1.8-2.0，并确保DNA无降解，样本保存期间切忌反复冻融，送样时请使用冰袋或干冰运输。

技术路线：

高通量分析流程

PCR-DGGE分析流程

生物信息与统计学服务：

案例分析：

标题：巴布亚新几内亚人肠道微生物：组成，多样性及生态形成过程 （Cell Reports, IF: 8.358）

研究领域：肠道微生物

分析物种：细菌

高通量测序平台：Illumina MiSeq

测序区域：16S rRNA gene V5-V6 region

主要结果：

(1）PNG和US人群肠道微生物多样性分析

（2）细菌多样性图谱

　　（3）

（4）

原文链接：http://www.cell.com/cell-reports/abstract/S2211-1247(15)00340-Xv

参考文献：

Martinez, I., J. C. Stegen, M. X. Maldonado-Gomez, A. M. Eren, P. M. Siba, A. R. Greenhill and J. Walter (2015). “The gut microbiota of rural papua new guineans: composition, diversity patterns, and ecological processes.” Cell Rep 11(4): 527-538.

微基生物进行人体健康相关的研究与应用：

肠道微生态，首发于微基生物。

　　口腔是人体微生物定植生存的重要生态区，口腔微生物不仅有细菌，还包括真菌、病毒、螺旋体及古细菌等。口腔内环境稳态易受外界因素的干扰，口腔内部有多位点、多层次的微生物定植生态区，口腔环境的异质性较肠道更为明显。正常情况下口腔微生物群落之间、微生物与宿主之间密切且复杂的相互作用维持着宿主健康，这种生态平衡被打破将会引发疾病。口腔主要疾病如龋病、牙周病及口腔癌等严重影响人类的生命健康。

　　基于16S rDNA/18S rDNA基因，优化实验方法，增加对痕量微生物的研究，利用高通量测序技术（Roche 454，Illimina MiSeq 2*300、Ion Torrent PGM）来分析口腔微生物的多样性，得到对微生物多样性、群落结构、种系关系精确的解析，增加人们对口腔健康与疾病相关微生物的认识。

呼吸道微生物

　　定殖于呼吸道部的微生物与人体始终处于动态生态平衡，对于维持人体健康发挥着重要作用，也与多种上呼吸道疾病的发生发展有密切关系。呼吸道微生物之间及其与宿主之间的相互作用是引发人体上呼吸道疾病的重要因素。人体呼吸道的密度只有104−105细胞数/cm²。
基于16S rDNA/18S rDNA基因，优化实验方法，增加对痕量微生物的研究，利用高通量测序技术（Roche 454，Illimina MiSeq 2*300、Ion Torrent PGM）来分析呼吸道微生物的多样性，得到对微生物多样性、群落结构、种系关系精确的解析，增加人们对呼吸道健康与疾病相关微生物的认识。

微基生物进行人体健康相关的研究与应用：

微基生物提供与人体健康相关的生信/统计服务：

更多微生态方向研究和生物信息方面服务，请详询：400-660-9270

口腔与呼吸道微生态高通量分析流程

样品采集及运送：

　　新鲜样品：分泌物2-3 mL

　　DNA样品：请提供浓度大于 10ng/uL，总量大于 500ng 的基因组 DNA，DNA 纯度较差或降解严重会影响后继的扩增实验。如果方便的话，可提供电子版DNA电泳检测照片及 OD260/280=1.8-2.0比值

　　样品运送：送样时采用干冰保存运输；若是距离较远，建议采用干冰加冰袋，存放于冰盒中。

• 生信/统计分析

案例分析

标题：患有牙周炎的患者口腔中的致病菌都是以牙龈沟产线菌为中心的微生物群落

研究领域：口腔微生物

高通量测序平台：Illumina MiSeq

测序区域：16S rRNA gene V3 region

　　牙周炎是一类多种微生物引起的广泛的口腔疾病，但对于其中协同作用的病原菌仍然知之甚少。用16S rRNA焦磷酸测序法对牙周炎患者和健康志愿者的唾液，牙龈，牙菌斑进行检测，不同口腔环境孕育着不同的微生物群落和菌种组成。两步冗余分析得出了21组OUT，包括Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia 和Filifactor alocis，作为可能引起牙周炎的病原菌；以及两种诊断牙周炎的参数：牙周袋深度和牙周附着丧失。有趣的是21个OUT的相似性分析结果得出Filifactor alocis肯定与其他7种假定的致病菌形成了一个协作群体，显著地在三位患者口腔中存在。这个发现展现了巨大的临床诊断价值，尤其是在口腔中。因此，我们的研究假定了一个协同致病的包括八种致病菌的菌群遍布所有牙周炎患者口腔中，并借此提供一个研究牙周炎致病菌的框架，以求未来研发出新的诊断和治疗方法。

主要结果

　　1.口腔微生物群的整体结构比较

　　2.龈下菌斑更加丰富的专性厌氧型微生物包括Porphyromonas、 Treponema、Tannerella,、Fusobacterium 、Filifactor

　　3.健康与牙周炎患者的唾液和龈上菌斑微生物的不同与RDA分析

　　4.OTU0263和其余7个OTU表现出强相关

　　5.在唾液中，共生组ROC曲线以下面积表示被测试同种系的最高，箭头意味着这个点对于诊断牙周炎的价值最大

原文链接：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25761675
参考文献：
Chen, H., Y. Liu, M. Zhang, G. Wang, Z. Qi, L. Bridgewater, L. Zhao, Z. Tang and X. Pang (2015). “A Filifactor alocis-centered co-occurrence group associates with periodontitis across different oral habitats.” Sci Rep 5: 9053.

口腔与呼吸道，首发于微基生物。

　　早期的皮肤微生物研究主要采用传统的分离培养方法，来识别和描述微生物群落的组成和多样性。传统方法的局限性使研究者难以正确全面地阐明皮肤微生物的群落结构和多样性特点。高通量测序从根本上改变了人们对微生物群落的认识，使人们得以系统地分析和认识皮肤微生物的群落及其功能。

　　基于16S rRNA/18S rRNA/ITS基因，优化实验方法，增加对痕量微生物的研究，利用二代测序技术（Roche 454、IlliminaMiSeq、Ion Torrent PGM）来分析皮肤微生物的多样性，为进一步理解皮肤的健康、疾病和感染等，全面了解皮肤微生物群落的结构特点及其与皮肤组织和环境的相互关系

微基生物进行人体健康相关的研究与应用：

微基生物提供与人体健康相关的生信/统计服务：

更多微生态方向研究和生物信息方面服务，请详询：400-660-9270

• 样品采集及运送：

　　新鲜样品：根据相关文献收集样品

　　DNA样品：浓度大于10 ng/uL，总量大于500 ng的基因组DNA，DNA纯度较差或降解会影响后继的扩增实验。如果方便的话，可提供电子版DNA电泳检测照片及 OD260/280的比值。

　　样品运送：送样时采用干冰保存运输；若是距离较远，建议采用干冰加冰袋，存放于冰盒中。

• 高通量测序流程：

• 生信/统计分析

案例分析

标题：人体皮肤微生物的多样性概况

研究领域：皮肤微生物

分析物种：细菌

取样方法：取皮肤表皮及皮下组织

　　高通量测序平台：Illumina MiSeq 2×150

　　测序区域：16S rRNA gene V4区

主要结果：
　　（1）无皮肤病史的五个样本左、右手的113个OUT的系统发育树结构丰度

　　（2）OUT单板描述

　　（3）.该图展示了样品根据它们Θ指数用UPGMA得到的发育树

　　（4）.相对丰度比较

原文链接：http://genome.cshlp.org/content/18/7/1043.short

参考文献：
Grice, E. A., H. H. Kong, G. Renaud, A. C. Young, G. G. Bouffard, R. W. Blakesley, T. G. Wolfsberg, M. L. Turner and J. A. Segre (2008). “A diversity profile of the human skin microbiota.” Genome Research 18(7): 1043-1050.

皮肤微生态多样性，首发于微基生物。

　　微基生物运用分子生物学结合高通量测序的方法，可以得到生殖道中绝大部分微生物的信息，并通过生信/统计分析，对大量数据进行处理和分析，找到在生殖道中与环境因子（抗生素使用、细菌性炎症等）相关的微生物群落组成，从而进行进一步的研究。

微基生物进行人体健康相关的研究与应用：

微基生物提供与人体健康相关的生信/统计服务：

更多微生态方向研究和生物信息方面服务，请详询：400-660-9270

生殖道微生态分析流程

• 样品采集及运送：

　　新鲜样品：用无菌棉拭子，于女性阴道侧壁1/3处取阴道分泌物，将棉签置于无菌管中，保存于-80℃冰箱中
　　DNA样品：样品需求量：≥ 300 ng；样品浓度：≥ 10 ng/μL；样品纯度：OD260/280=1.8-2.0并确保DNA无降解

　　样品运送：干冰寄运

• 生信/统计分析

案例分析

标题：欧洲妇女产前和产后一段时间内阴道微生物的变化

研究领域：生殖道微生物

分析物种：细菌

　　（1）细菌多样性在产后妇女的阴道中明显增加

　　（2）在怀孕8周一直到产后，阴道微生物的在种水平上的组成变化图

　　（3）在英国妇女中，从产前至产后的整个过程中，阴道微生物类群的变化图（不同颜色代表不同的细菌种类）

　　（4）主要微生物类群在不同人种之间的差异

原文链接：http://www.nature.com/articles/srep08988

参考文献：

MacIntyre, D. A., M. Chandiramani, Y. S. Lee, L. Kindinger, A. Smith, N. Angelopoulos, B. Lehne, S. Arulkumaran, R. Brown, T. G. Teoh, E. Holmes, J. K. Nicoholson, J. R. Marchesi and P. R. Bennett (2015). “The vaginal microbiome during pregnancy and the postpartum period in a European population.” Sci Rep 5: 8988.

生殖道微生态研究，首发于微基生物。