16S rRNA基因高通量测序的关键点-测序区域的选择

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16s rRNA基因高通量测序的关键点-测序区域的选择，首发于微基生物。

基于16S rRNA基因的高通量测序分析

案例介绍

文章简介：国家海洋局第一海洋研究所利用高通量测序平台对南极菲尔德斯半岛土壤微生物多样性进行研究。该研究成果发表于《Frontiers in microbiology》（影响因子3.989）

英文题目：Diversityand structure of soil bacterial communities in the Fildes Region（maritime Antarctica）as revealed by 454 pyrosequencing

中文题目：南极菲尔德斯半岛土壤细菌群落多样性和结构的研究

测序平台：Roche454

测序区域：16SV1-V3

分析样本：土壤样本

　　要点简析：采用高通量测序技术对南极地区菲尔德斯半岛的人类聚居地、企鹅聚居地、海象聚居地和原始区域土壤细菌群落多样性和结构进行研究。研究表明四种类型土样的细菌群落结构存在显著差异，通过冗余分析发现，pH、磷、有机碳、有机氮是影响土壤细菌群落分布的最主要因素。

　　研究背景：南极气候非常恶劣，其简单的生态系统极易受到气候变化、人类活动等干扰因子的影响。近年来随着气候的变暖，无冰的区域将扩大，企鹅、海象将逐渐增多，人类活动将更加频繁，陆地微生物可能会发生变化，因此很有必要了解南极地区无冰区土壤微生物和人类、动物之间的关系。

　　菲尔德斯半岛是南极地区最大的无冰区，人类活动频繁，企鹅和海象也比较常见。因此选择在该地区采用454高通量测序技术，对人类聚居地、企鹅聚居地、海象聚居地和原始区域土壤细菌群落多样性和结构进行研究。

主要结果：

　　在4种类型土样中，土壤细菌多样性最大的是企鹅聚居地土壤，其次是原始土壤、人类聚居地土壤和海象聚居地土壤。4种类型的土样中都含有丰富的变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、疣微菌门。4种类型土样的化学性质和细菌群落的结构存在显著差异。4种类型土壤中，热袍菌门、蓝藻、纤维杆菌门、耐辐射嗜、绿菌门在丰度上存在显著差异。通过基于距离的冗余分析发现，pH、磷、有机碳、有机氮是影响土壤细菌群落分布的最主要因素。

样品的Venn图

50个OTUs的网络图

基于16S rRNA基因的微生物多样性分析—高通量测序，首发于微基生物。

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　　对于微生物群落多样性分析，基于Roche 454 FLX +、Illumina MiSeq、Ion Torrent PGM等高通量测序平台，对核糖体DNA高变区域，比如16S/18S/ITS等序列或功能基因，比如细菌和古菌的氨氧化酶基因、硫酸盐还原菌的异化型亚硫酸盐还原酶基因进行测序分析，揭示环境样品中众多不同类型微生物种类以及它们之间的相对丰度和进化关系。

　　MiSeq测序系统采用Illumina成熟的TruSeq边合成边测序技术，集扩增、测序和数据分析的测序仪，每次运行能产生超过7 Gb的数据，循环时间短、测序准确，通过专利的可逆终止试剂方法对数百万片段进行平行测序。当dNTP加入时，对荧光标记的终止子成像、切割、到下一个碱基的掺入。由于每个测序循环中四种可逆终止子结合的dNTP都存在，所以自然竞争让掺入偏差最小化。根据每个循环的荧光信号测定直接检出碱基，与其他技术相比大大降低了原始错误率和可靠的碱基检出。

MiSeq新型测序流程：
　　制备文库的DNA起始量可低至50 ng
　　簇生成和测序都在MiSeq上完成
　　最后在内置的仪器计算机上开展数据分析
平台优势：
　　价格低
　　Miseq测序长度长约500bp
　　高通量测序产出高
　　全自动的工作流程
　　最精准的数据质量
应用领域：
　　靶向重测序 (Targeted Resequencing)
　　PCR扩增：基于Nextera的快速文库制备（1.5小时）和36 bp测序
　　高度多重的扩增子测序 (Amplicon Sequencing)
　　杂交捕获 (Hybrid Capture)
　　16S宏基因组 (16S Metagenomics)
　　克隆检验 (Clone Checking)
　　小基因组测序 (Small Genome Sequencing)
　　de novo测序
　　重测序
　　质粒测序
　　RNA测序 (RNA Sequencing)
　　小RNA测序
　　RNA-seq
　　文库质控
　　调控
　　ChIP-seq

Roche 454
工作原理： 
　　454高通量测序是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。
工作流程： 
　　1、文库制备：根据样品的种类和实验目的，将基因组DNA/cDNA片段化处理至300-800bp间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA；
　　2、Emulsion PCR：单链DNA文库被固定在DNA捕获磁珠上，每个磁珠结合了一个独立的单链DNA片断。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增后仍结合在磁珠上的片段既可被回收纯化用于后续的测序实验；
　　3、测序反应：携带DNA片段的磁珠被放入PTP板中供测序反应使用。PTP孔的直径（29um）确保每个孔只能容纳一个珠子（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX中，每个核苷酸依次流入开放的孔洞和DNA捕获磁珠建。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号，并被测序仪CCD照相机所捕获；
　　4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100余万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，并应用于不同领域。
技术特点： 

• 速度快
• 测序读长最长,平均400-500个碱基；
• 准确度高
• 一致性好
• 可以进行Pair－End测序研究；

应用范围：
　　1、全基因组测序
　　2、比较基因组研究
　　3、转录组和基因调节研究
　　4、扩增产物分析

Ion Torrent PGM
应用领域：微生物基因组测序和重测序，靶基因目标（扩增子）区域重测序
扩展性：半导体芯片技术
简捷：自然的生物化学原理
快速：2个小时完成测序
　　Ion Torrent Personal Genome Machine(个人操作基因组测序仪以下简称：PGM™)，相较其他测序技术，更简单、经济和扩展性更好的测序平台。PGM™台式系统配合革新性的半导体芯片技术，使整个平台具有极高的扩展性和快速完成测序的性能。
Ion Torrent技术通过专有的大规模并行半导体感应器，对DNA 复制时产生的离子流，实现直接和实时的检测。当试剂通过集成的流体通路进入 Ion Torrent 半导体芯片中，密布于芯片上的反应孔立即成为上百万个微反应体系。这种独特的流体体系，微体系机械设计和半导体的技术组合，使我们得以快速直接的将遗传信息翻译成数码的 DNA 测序结果，得到大量高质量的测序数据。
　　PGM™服务整合Ion Torrent 的半导体芯片、反应试剂盒、计算机服务器和数据分析套件为您提供最全面最优质的测序服务。
PGM™更高通量，更大价值，其测序通量完全超过其他测序通量高出至少一个数量级。

高通量测序平台，首发于微基生物。

• 数据库：Silva，RDP

微基生物拥有Silva、RDP数据库，其中Silva数据库是目前使用最广泛的数据库，目前涵盖非重复18S rRNA基因序列及分类信息51553条。

• 高通量测序

微基生物是国内首家采用Illumina-MiSeq 2×300 bp平台进行微生物生态研究，其读长可达到550 bp，适合对真核生物18S rRNA基因的V4区进行测序分析。

• 生信 / 统计分析

  结果展示： 案例分析： 标题：北冰洋中心区新开水域微微型浮游植物优势地位分析 分析物种：微微型浮游植物 高通量测序平台：Roche 454 测序区域：18S V4区 主要实验结果： 微微型浮游植物为该海域的优势群落，可占叶绿素生物量的44%-80%。青绿藻、硅藻、蓝细菌、金藻及甲藻为鉴定出的主要光合浮游生物纲，分别占到微微型浮游植物的0–88%, 2–80%, 0–20%, 4–14% 及2–11%。其中真核生物的优势属（种）为塔胞藻Pyramimonas (Pyramimonas gelidicola), 微胞藻Micromonas (Micromonas pusilla) 及棕囊藻Phaeocystis。值得注意的是，高通量测序分析的结果表明，塔胞藻要比泛北冰洋优势种微胞藻的相对丰度高3倍；而Pyramimonas gelidicola也为第一优势种，要比一直认为的北冰洋夏季第一优势种Micromonas pusilla高1.5倍。典型相关性分析（CCA）结果表明：纬度和盐度是影响微微型浮游植物群落组成及分布的主要因素。 图1 微微型浮游植物的群落组成及环境因子分布的CCA展示图 图2 微微型浮游植物的群落组成（基于HPLC 色素分析及CHEMTAX方法）
原文链接：http://link.springer.com/article/10.1007/s00300-015-1662-7 参考文献：
　　Zhang, F., J. He, L. Lin and H. Jin (2015). “Dominance of picophytoplankton in the newly open surface water of the central Arctic Ocean.” Polar Biology 38(7): 1081-1089.

真核生物 18S rRNA，首发于微基生物。