一、自发荧光淬灭试剂盒产品规格

备注：T表示可处理切片数量，适配5-15μm常规冰冻切片厚度。若切片厚度增加，可适当增加试剂用量。

二、适用样本类型及淬灭效果展示

动物组织、植物根系等高自发荧光冷冻切片样本；

含有外源性荧光杂质的石蜡切片样本。

组织冰冻切片样本使用自发荧光淬灭试剂盒淬灭前vs 淬灭后测试效果图

组织冷冻切片自发荧光淬灭效果等级评价 

三、自发荧光淬灭试剂作用原理

本试剂盒可针对性抑制与清除样本中引发自发荧光的各类物质：既能作用于内源性脂溶性荧光物质（如脂褐素）、内源性过氧化物酶、胶原纤维、弹性纤维等自身荧光基团，也可有效去除样本预处理过程中产生的外源性非特异性荧光杂质（如石蜡微晶、组织固定液残留荧光物质）。

试剂盒配备两种荧光淬灭剂，既可单独使用，也可协同增效，靶向清除自发荧光成分；全程不干扰探针杂交及后续荧光信号读取，不影响实验核心流程，确保检测结果真实可靠。

三、储存条件

试剂盒未开封组分：2–8℃冷藏避光保存，严禁冷冻、高温及强光照射。

严格遵循储存要求，可有效保证试剂活性与淬灭效果。

配制后的工作液建议现配现用；若短期保存，可密封后于2–8℃冷藏避光储存，并在48小时内使用完毕。

四、产品优势

多通道兼容：覆盖FISH检测常用荧光通道，一站式解决多荧光标记样本的自发荧光问题；

高效特异性：靶向清除自发荧光成分，不影响探针与靶标结合，不干扰后续信号读取；

适配性广：适用于动植物多类高自发荧光荧光的冷冻切片和石蜡切片切片，拓展性强；

操作灵活：两种淬灭剂可单独/协同使用，满足不同样本和切片类型的处理需求。

获取产品详细说明书、实验方案及报价信息，专业技术团队为您解答实验难题！咨询热线：021-50763698

本产品仅供科研使用，不用于临床诊断

FISH检测石蜡切片自发荧光淬灭试剂盒

FISH检测植物根系冷冻切片自发荧光淬灭试剂盒

FISH检测组织冰冻切片自发荧光淬灭试剂盒

16S FISH检测 自发荧光淬灭试剂盒，首发于微基生物。

Q1：冻干探针管上标注的“2OD”是什么意思？如何快速换算成质量浓度？

A：①“2OD”是核酸类探针合成时的光密度值，为定量单位而非质量单位。（OD即光密度，1OD≈40μg/mLdsDNA），

②示例：若标注为”To100μM，加50μL，总质量100μg，WM：8000″

稀释到25μM：需加4×50μL=200μL溶剂

质量浓度：(100μg×1000ng/μg)÷200μL=500ng/μL

Q2：探针管上标注的“WM（分子量）”有什么实际用途？实验中需要用到这个数值吗？

A：分子量是合成过程中计算“特定浓度所需溶剂体积”的核心依据，客户无需单独使用该数值，直接按标注的“To[目标浓度]μM，加[Xμl]”操作即可，无需自行二次计算。

二、稀释操作相关疑问

Q3：探针稀释用无菌水还是TE缓冲液？两者对实验结果有影响吗？

A：两者均可，但各有侧重：

无菌水：适合立即使用的探针（短期内使用完，如1周内使用）

TE缓冲液（pH8.0）：含Tris和EDTA，能稳定pH并螯合Mg²⁺，显著延长探针稳定性，适合长期分装保存。

推荐方案：优先使用TE缓冲液，尤其是需多次使用的探针。

注意：TE缓冲液需用DEPC水配制，避免RNase污染。

Q4：稀释时加错了溶剂体积（比如多加/少加），能补救吗？

A：①少加溶剂（浓度偏高）：可根据“C1V1=C2V2”补加溶剂

例如：应加200μL溶剂（目标25μM），实际加了150μL，需补加溶剂体积=（25×200-25×150）/25=50μL（补加后总体积200μL，浓度恢复25μM）；

②多加溶剂（浓度偏低）：无法补救，因探针总质量固定，多加的溶剂会稀释总浓度，且无法分离多余溶剂，需重新合成探针或使用备用分装液重新稀释。

Q5：稀释探针时，溶剂加完后需要怎么处理？是否需要离心或剧烈震荡？

A：①加完溶剂后，轻轻颠倒离心管数次混匀即可，禁止剧烈震荡（避免破坏探针的核酸链结构和荧光基团）；

②无需额外离心，若探针未完全溶解，可在室温避光静置5–10分钟，再轻轻颠倒混匀，直至完全溶解（冻干探针溶解需要一定时间）。

三、浓度换算相关疑问

Q6：如何将25μM的存储液稀释到FISH试剂盒要求的10~15ng/μL工作浓度？

A：换算公式:

质量浓度（ng/μL）=摩尔浓度（μM）×分子量（Da）×10^-3

示例：探针分子量WM=8000Da，说明书标注稀释为25μM

存储液浓度=25×8000÷1000=200ng/μL

试剂盒要求10~15ng/μL，WM=8000Da

10ng/μL对应的摩尔浓度=10×1000÷8000=1.25μM

15ng/μL对应的摩尔浓度=15×1000÷8000=1.875μM

您需要将25μM的存储液稀释13~20倍（25÷1.25=20，25÷1.875≈13）

四、保存条件相关疑问

Q7：探针稀释后分装，每次取用时如何防止反复冻融和荧光淬灭？

A：反复冻融是导致探针降解和信号衰减的首要原因，分装操作建议：

1.首次稀释：按4X体积稀释至25μM后，立即分装为5-10μL/管（单次用量）；

2.保存：分装后用锡纸包裹离心管，-20℃避光，避免放入自动除霜冰箱的冷冻层；

3.取用：每次取1管，4℃避光当天用完，尽量当日使用完；若单管未用完，用铝箔严密包裹后放4℃，24h内用完，严禁二次冻存。

Q8:为什么推荐将探针稀释到25μM作为存储浓度，而不是直接用100μM存储或使用？

A：25μM是兼顾“稳定性”和“使用便利性”的最优存储浓度，在-20℃（短期）或-80℃（长期）保存时，可显著延长探针的活性有效期。100μM浓度过高长期冻存容易发生分子间聚集甚至微量沉淀，导致有效浓度下降。

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FISH检测试剂盒使用疑问解答

16S FISH探针定制使用相关疑问解答，首发于微基生物。

Q1：3种浓度的Hybridization Buffer（20%/30%/40%）该如何选择？没有明确方向，完全需要盲目摸索吗？

A：浓度选择取决于样本类型和探针特性，以下选择可供参考：

20%：适合细菌涂片、细胞悬液等简单样本（即样本中目标细菌含量较高）

30%：通用起始浓度，推荐首次测试使用，适用于大部分组织切片和常规探针

40%：适合复杂组织基质（如肠道组织）、富含黏液的样本，或需要严格杂交条件的探针（高浓度杂交液可提升特异性），样本中细菌丰度低或土壤/污泥样本（易出现非特异性杂交）可尝试40%浓度。

Q2：Washing Buffer（10×）稀释前是浑浊白色，稀释后澄清有少量泡沫，这是正常现象吗？若稀释前未摇匀会有什么影响？

A：属于正常现象。Washing Buffer是浓缩缓冲盐溶液，长期静置后溶质会沉降分层。

说明书明确标注“稀释前必须摇匀，摇匀后呈浑浊白色液态，稀释后变澄清且有少量泡沫”，操作建议：使用前剧烈摇晃1-2分钟，确保护壁无结晶残留（必要时可低温加热）。稀释后泡沫属正常现象，不影响性能。

若稀释前未摇匀，会导致Washing Buffer中有效成分分布不均，后续洗涤时无法充分去除未结合的探针，可能造成荧光背景偏高，影响检测结果准确性。

Q3：DAPI-Antifade Solution不小心见光了还能使用吗？-20℃避光储存的要求是否必须严格遵守？

A：①若短时间（如10分钟内）见光，可继续使用，但荧光信号可能略有衰减；若长时间暴露在强光下（如半小时以上），不建议使用，因DAPI荧光基团对光敏感，见光易淬灭，会导致后续染色效果变差。

② 必须严格遵守-20℃避光储存要求，否则会加速荧光基团降解，直接影响最终镜检时的荧光信号强度。

Q4：FISH封片剂的“指示效果”具体是指什么？

A：该封片剂的核心功能是：

物理隔绝：杂交期间防止Hybridization Buffer蒸发，维持湿润环境。

化学保护：含特殊保湿成分，避免盖玻片下液体干涸导致探针局部浓度过高。

操作指示：其颜色标记便于识别封片位置，移除时不易残留。

该染色剂不与细菌或探针发生相互作用，因此不会干扰检测结果。

二、自备物品相关疑问

Q5：FISH荧光探针浓度范围只能是10~15 ng/μL吗？

A：浓度建议控制在10~15 ng/μL：浓度过低会导致杂交信号弱，难以检测；浓度过高易引发非特异性结合，增加背景荧光，

探针浓度与杂交时间成反比关系，高浓度需缩短时间防止非特异性结合。

Q6：二甲苯的替代品有哪些？有没有推荐的安全替代品？

A：可选择常用的环保脱蜡剂（如柠檬烯脱蜡剂、植物源脱蜡液等），但需满足以下要求：

① 脱蜡效果与二甲苯相当，能彻底去除石蜡切片中的石蜡成分；

② 不影响后续探针杂交和荧光信号。

使用前建议先做小样本验证，确认脱蜡后样本组织形态完整、无损伤。

Q7：没有现成的避光湿盒，该如何自制？

A：①密封性好的塑料盒或培养皿，底部铺一层浸湿的滤纸（注意保持湿度，避免干涸）；

② 用锡纸将盒子整体包裹（实现避光作用）；

③ 放入样本玻片时，确保玻片水平放置，避免杂交液流淌。

注意：湿盒内湿度需充足，杂交过程中不可打开锡纸（防止强光照射）。

三、实验操作相关疑问

Q8：不同类型样本的预处理（烤片、脱蜡）时间/温度是否有相关的调整建议？

A：预处理的核心是“去除杂质、固定样本形态”，参考建议：

Q9：Solution A和Solution B的处理时间如何根据具体样本进行调整？

A：调整基本原则“样本越厚、老化程度越高，处理时间越长”，调整参考建议：

Solution A（37℃）：薄标本（如薄冰冻切片、细胞涂片）保持10-15min；厚标本（如厚石蜡切片、土壤涂片）延长至15-20min。

Solution B（37℃）：常规样本15-20min；厚标本或老化标本延长至20-25min；若样本中细菌细胞壁较厚（如革兰氏阳性菌为主），可按25-30min处理。

Q10：杂交过夜时间范围18-72h差异大，如何确定最佳时长？

A：调整基本原则是“样本菌体含量越少、复杂程度越高，杂交时间越长”，参考建议：

常规样本（新鲜组织、活跃菌群涂片）18-24h即可；

低丰度细菌样本（如罕见菌检测、低污染样本）可延长至48h；

极难杂交的样本（如休眠细菌、厚壁菌）可延长至72h，无需担心“过度杂交”（本试剂盒杂交体系稳定性强，72h内不会出现非特异性过度结合）。

Q11：洗涤时盖玻片3-5min未自动脱落，能手动取下吗？Washing Buffer工作液未预热到37℃，会有影响吗？

A：①不建议手动取下，手动取盖玻片易刮伤样本组织或蹭掉已结合的探针，若3-5min未脱落，可将玻片在1×Washing Buffer工作液中轻轻晃动1-2次，促进盖玻片脱落，仍未脱落则延长浸泡时间至5-8min；

② 有影响：Washing Buffer工作液预热至37℃是为了维持杂交后的稳定环境，有效去除未结合的探针；若温度过低（如室温25℃以下），未结合的探针难以脱离，会导致背景荧光偏高，因此需将工作液预热至37℃再使用。

Q12：DAPI-Antifade Solution滴加后静置15min，若时间不够会怎样？滴加多少合适？

A：①静置时间不够会导致DAPI染色不充分，细菌细胞核荧光信号弱，难以观察到细菌的定位；若已不足15min，可在暗处补静置5min后再镜检；

②滴加量以“刚好覆盖样本表面”为宜，无需过多（避免溢出浪费），也不能过少（未覆盖区域无法染色），滴加后立即盖盖玻片（避免见光）。

四、结果分析类

Q13：背景荧光过强，如何区分是自发荧光还是非特异性杂交？

A：自发荧光：全通道均匀高亮，无探针的阴性对照也出现，常见于肠道组织、土壤样本中。

非特异性杂交：特定探针荧光通道出现点状或片状信号，阴性对照无此现象。

操作建议：实验过程中增加空白对照（无探针）检测，用于排除是否为样本自发荧光情况。

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16S FISH探针定制使用相关疑问解答

FISH检测试剂盒使用疑问解答，首发于微基生物。

微基生物依托荧光原位杂交（FISH）技术，提供植物根际微生物专业化 FISH 检测与冷冻切片制备服务，无需复杂培养即可实现原位定位分析，最大程度保留根际微环境中微生物的真实群落结构与分布情况。

一、FISH检测服务核心原理

荧光原位杂交（FISH）技术基于核酸分子杂交原理，针对根际样本中目标功能微生物（如固氮菌、解磷菌、植物促生菌等）的 16S rRNA 或功能基因序列，设计特异性互补荧光标记探针；探针与样本中目标微生物核酸在适宜条件下特异性结合过荧光显微镜或荧光扫描设备在细胞/组织原位观察荧光信号，实现微生物的精准定性，清晰反映根际微环境中微生物的空间分布与群落结构特征。

二、 FISH 检测服务内容

1.根际微生物 FISH 检测

针对植物根系及根际土壤微生物群落，开展样本前处理、探针杂交、荧光成像与图像分析全流程，清晰解析微生物在根系表面、根内的定殖位点及丰度特征，可检测根际促生菌（PGPM）、固氮菌、溶磷/溶钾菌等功能微生物的定殖能力与持久性。

注：图中红色荧光信号为根际细菌（EUB338通用探针标记），绿色信号为特定PGPM（定制探针标记），展示微生物在根表及根毛区的聚集分布（参考 Watt et al., 2006 小麦根FISH成像方法）。

2.多技术联合检测（定制化）

整合传统分离培养方法（选择性/富集培养基筛选）与qPCR、高通量测序等分子生物学技术，实现微生物“可培养类群鉴定+原位分布分析+群落整体多样性解析”的全方位检测，显著提升微生物检出率，全面还原植物微生态群落的结构与功能。

注：基于Romano et al., 2020提出的多方法联合评估框架优化设计，实现微生物定殖与持久性的综合分析。

三、技术优势

1.原位精准定位：无需分离培养，直接在根际微环境中定位目标微生物，真实反应器空间分布与互作关系。

2.探针高特异性：基于16S rRNA序列设计特异性探针，精准靶向特定功能微生物或微生物类群。

3.技术兼容性：可与分离培养、qPCR、高通量测序等技术联用，实现微生物群落的多维度分析。

4.样本适用范围广：适用于农作物、模式植物、林木等的根、叶等组织及相关土壤样本。

5.抗干扰能力优： 自主研发植物组织样本自发荧光淬灭试剂盒，专项解决植物根系样本高自发荧光干扰问题。

四、样本采集

1.根际土壤样本

收集紧密附着在根表 1–2mm 范围内的根际土壤，装入无菌离心管，采集量为2–5g。

2. 根表微生物样本（洗脱液 / 根段）

·  根表洗脱液：取 1–2cm 长的新鲜根段，置于含无菌 PBS 缓冲液的离心管中，充分振荡洗脱根表微生物，收集洗脱液后离心沉淀（建议沉淀量≥5mg）；

·  根段样本：直接取 1–2cm 根段，立即置于 4% 多聚甲醛固定液中，4℃，避光保存。

五、服务流程

1.样本接收与前处理：接收客户提交的根际样本，去除植物组织碎片、杂质等干扰物，完成样本均质化处理。

2.样本固定：采用专用固定液处理样本，维持微生物细胞形态与核酸完整性。

3.冷冻切片/土壤涂片：对固定后的根系组织样本或土壤样本进行合适的样片制备。

4.荧光原位杂交：加入定制化荧光探针，在严格控温条件下完成核酸杂交反应。

5.荧光图像扫描：通过专业的荧光扫描设备，对杂交后的样本进行扫描成像。

6.结果分析与报告：对荧光信号进行定性定量分析，生成可视化结果与专业检测报告。

检测结果展示

植物根系纵向切片展示

植根系纵向切片展示

蓝色荧光（DAPI染色）：呈现根系样本中所有细菌的整体分布；红色荧光（FISH探针标记）：定位目标功能微生物。图像叠加可直接观察目标菌在总群落中的位置与占比，快速判断目标菌的存活状态与富集情况。

欢迎科研机构、农业研发企业前来咨询合作，我们将为您提供专业的根际/叶际微生物 FISH检测解决方案，助力植物微生物组研究与绿色农业发展。

参考文献：

1. Peredo, E.L., & Simmons, S.L. (2018). Leaf-FISH: Microscale Imaging of Bacterial Taxa on Phyllosphere. Frontiers in Microbiology, 8: 2669.

2. Romano, I., Ventorino, V., & Pepe, O. (2020). Effectiveness of Plant Beneficial Microbes: Overview of the Methodological Approaches for the Assessment of Root Colonization and Persistence. Frontiers in Plant Science, 11: 6.

3.Watt, M., Hugenholtz, P., White, R., & Vinall, K. (2006). Numbers and locations of native bacteria on field-grown wheat roots quantified by fluorescence in situ hybridization (FISH). Environmental Microbiology, 8(5): 871-884.

根际微生物 切片&16S FISH检测服务，首发于微基生物。

微基生物IF-FISH共检测服务，创新融合FISH与IF优势：以微生物特异性核酸探针（如16S rRNA探针）实现对微生物的精准定位与定性，明确其定植区域及聚集状态，同时借特异性抗体标记，量化宿主目标蛋白表达并解析细胞功能，实现微生物定位、活性及宿主互作的多维解析。

服务流程

实验关键注意事项

1.探针-抗体兼容性优化：针对不同抗体的孵育温度、时间、浓度参数，定制专属杂交方案，避免交叉干扰，确保双重信号高效捕获。客户需提供抗体。

2.严格质控体系：设置阳性对照（已知阳性样本）、阴性对照（无探针孵育组）、探针特异性对照及抗体阴性对照，严格优化杂交温度、洗脱强度等条件，确保特异性信号检测。

3.多通道检测支持：支持4色荧光通道同步检测（含DAPI染核通道），可同时标记3种目标微生物，满足复杂实验设计需求。

4.样本质量要求：石蜡切片需经梯度脱蜡确保探针穿透性，冰冻切片快速固定防止组织自溶，菌液/涂片样本优化分散度避免聚集影响观察。

样本类型与检测周期   

支持样本：冰冻切片、石蜡切片、菌液/菌体涂片、活性淤泥样本等

检测周期：实验材料（样本、抗体、探针等）备齐后2-4周，具体以合同约定为准

文献分享 

肿瘤内微生物促进乳腺癌转移机制研究

（文献来源：Fu A K, Yao B Q, Dong T T, et al. Tumor Resident Intracellular Microbiota Promotes Metastatic Colonization in Breast Cancer〔J〕. Cell, 2022）

1.检测方法：

采用FISH与IF共检测技术，以16S rRNA FISH探针标记细菌，结合角蛋白8+18、LPS、LTA 等特异性抗体，同步实现微生物定位与宿主细胞/蛋白标记，搭配DAPI染核完成多维度观测。

2.关键检测结果与图像解析：

1）肿瘤组织中微生物定位

16S FISH与IF共染色证实，肿瘤内细菌主要定植于肿瘤细胞细胞质内，核周区域呈点状分布，且同时存在革兰氏阳/阴性菌，证实肿瘤组织存在稳定定植的微生物群落。

(A) 16S FISH分析（红色）显示细菌在核周区域呈点状分布；(B) LPS IHC染色（革兰氏阴性菌，红色）；(C)LTA染色（革兰氏阳性菌，红色），蓝色为DAPI染核。

2）肺转移灶中微生物分布

肺转移灶区域富集大量细菌信号，正常肺组织中细菌信号极少，证明肿瘤细胞转移时会携带微生物定植于远端器官。

(F)16S FISH分析带有PyMT肿瘤转移的肺组织切片。

(G) 血液中角蛋白8+18抗体和16S探针染色和定量循环肿瘤细胞中的细菌。

注：红色-16S FISH 探针，蓝色-DAPI，绿色-肿瘤细胞标志物。

微基生物凭借专业的技术团队、标准化的实验流程、先进的检测设备及丰富的项目经验，为您提供优质的微生物FISH与IF共检测服务。我们将全程为您提供技术支持，从实验设计到结果解读一站式解决，助力您在科研道路上快速突破、成果斐然！

微生物FISH与IF共检测，首发于微基生物。