关于特定种类的微生物，客户可告知物种信息及引物信息，微基生物针对目标微生物进行qPCR定量分析；也可告知感兴趣的物种名称，微基生物来查询相关引物信息；如老师感兴趣的物种信息尚未见文献报道，微基生物可以开发程序，自行研发寻找目标菌株的特异基因并设计目标菌株的特异引物，验证引物的特异性，进行后继实验。
微基生物已检测过的物种信息，见表格（仅列出了常见的部分微生物种类），其他的微生物也可以检测。

级别	中文名称	英文名称
界	细菌	Bacteria
界	真菌	Fungi
界	古菌	Archaea
门	放线菌门	Actinobacteria
门	拟杆菌门	Bacteroidetes
门	厚壁菌门	Firmicutes
纲	alpha变形菌纲	Alpha-proteobacteria
纲	gamma变形菌纲	Gamma-proteobacteria
科	肠杆菌科	Enterobacteriaceae
科	瘤胃球菌科	Ruminococcaceae
属	双歧杆菌属	Bifidobacterium
属	大肠杆菌属	Escherichia
属	乳酸杆菌属	Lactobacillus
属	梭菌属	Clostridium
属	肠球菌属	Enterococcus
属	拟杆菌属	Bacteroides
属	奇异菌属	Atopobium cluster
属	链球菌属	Streptococcus
属	瘤胃球菌属	Ruminococcus
属	粪杆菌属	Faecalibacterium
属	布劳特菌属	Blautia
属	艰难梭菌属	Clostridium difficile
属	脱硫弧菌属	Desulfovibrio
属	另支菌属	Alistipes
属	链球菌属	Streptococcus
属	萨特氏菌属	Sutterella
属	丙酸杆菌属	Propionibacterium
属	假单胞菌属	Pseudomonas
属	噬酸菌属	Acidovorax
属	不动杆菌属	Acinetobacter
属	鞘氨醇单胞菌属	Sphingomonas
属	分枝杆菌属	Mycobacterium
属	普氏菌属	Prevotella
种	溶纤维丁酸弧菌	Butyrivibrio fibrisolvens
种	蛋白溶解梭菌	Clostridium proteoclasticum
种	金黄色葡萄球菌	Staphylococcus aureus
种	青春双歧杆菌	Bifidobacterium adolescentis
种	鼠李糖乳杆菌	Lactobacillus rhamnosus
种	粪肠球菌	Enterococcus faecalis
种	呀卟啉单胞菌	Porphyromonas gingivalis
种	阴道加德纳菌	Gardnerella vaginalis
种	鼠乳杆菌	Lactobacillus murinus
种	解淀粉芽孢杆菌	Bacillus amyloliquefaciens
种	芽孢杆菌	Bacillus velezensis
种		Akkermansia muciniphila
种	酿酒酵母	Saccharomyces cerevisiae
株	唾液链球菌 K12	Saliva streptococcs

 2 qPCR的原理

实时荧光定量PCR技术（Real-timeQuantitativePCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终通过相对定量（与内参基因对比）或绝对定量（通过标准曲线对未知模板进行定量）的方法确定各个样本的本底表达量。

 3 3种荧光试剂的工作原理及区别

SYBRGreenⅠ法：

嵌入到双链DNA分子后在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后构象发生变化，能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光；而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

TaqMan探针法：

扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步

 SYBRGREEN法和TaqMan探针法的区别

方法	优点	缺点
SYBR GREEN法	高灵敏度，操作简单，不影响酶促反应，价格便宜	1与探针法相比，对引物特异性要求较高，需进行熔解曲线分析 2灵敏度相对较低。
TaqMan 探针法	1具有高度特异性 2更高的灵敏度 3可同时检测几种不同的荧光信号的产物	1探针价格较高 2需要不同引物的扩增效率一致，对引物的设计及扩增条件要求比较高

 4 qPCR的实验方法

实验方法	原理	技术应用	相关应用
绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ)	是测定目的基因在样本中的分子数目，通过构建标准曲线对未知模板进行分子数目的定量，即通常所说的拷贝数。	特定微生物的拷贝数检测 特定功能基因的拷贝数检测 特定抗性基因的拷贝数检测	1临床疾病诊断 2动物疾病检测 3食品安全 4科学研究 5应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
相对定量(RelativeQuantification，RQ)	测定目的基因在样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的绝对拷贝数，一般是通过CT值之差来计算。	样本中某种特定微生物拷贝数占全部微生物拷贝数的比例 某种功能基因的微生物拷贝数占全部微生物拷贝数的比例 某种抗性基因拷贝数占全部微生物拷贝数的比例

 相对定量和绝对定量的数据计算方法

标准质粒拷贝数计算：

每微升拷贝数（copies/μl）=[质粒浓度（ng/ul）×10-9×6.02×1023]/克隆产物相对分子质量
原始样本目标基因拷贝数copies/μLDNA=拷贝数*稀释倍数
原始样本目标基因拷贝数copies/g样本=（原始样本目标基因拷贝数copies/μLDNA*基因组DNA体积）/样本抽提重量，（如果客户样本为DNA样本，则不需要计算copies/g样本）

相对定量的计算：

步骤1:内参基因均一化样本差异：Ct目的基因–Ct内参基因=△Ct

步骤2:其他样本和对照样本比较：△Ct处理样本–△Ct对照样本=△△Ct

步骤3:使用公式计算：倍数变化=2-△△Ct

 5 qPCR的实验流程

 6 qPCR检测送样要求

	样本类型	样品量/例	备注
环境	土壤/沉积物/淤泥	1g
	湖水/海水/河水	1L，用滤膜或离心富集	过 0.22μm 的滤膜，或者 12000rpm 离心，进行富集。
	污水	20ml	若样本清亮则可适当地多取。
	泥水混合样	2ml
	空气	根据实验需要，用无菌滤膜过滤空气。
	发酵物	固体 2g，液体 20ml

	样本类型	样品量/例	备注
人体	粪便	≥3g
	皮肤	5 个采集拭子	采集 5cm*5cm 面积，反复刮取 20 次。
	生殖道	5 个采集拭子	采集阴道口内 4cm 处分泌物， 每个拭子转 3 圈。
	牙菌斑/舌苔	5 个采集拭子	在采集的部位，刮取 10 次左右。
	唾液	10ml
	痰液	10ml 或 2-3 口痰液
	鼻腔	5 个采集拭子	采集鼻腔内粘膜上的分泌物，转 3 圈。
	肺部灌洗液	30ml 富集液	对灌洗液进行离心富集。
	肠道/胃组织	5mm*5mm*3mm 3 块	尽量多一取些。
	血液	3ml 全血	用 EDTA 抗凝管，颠倒 8-10 次。 不建议用肝素。
	尿液	30mL 尿液	取中段尿为宜。
	母乳	5mL
动物	粪便	≥3g	最少 0.05g。
	盲肠/结肠/胃 组织	≥3g	至少 1g，如果实验条件允许，尽可能多的收集样本
	肠道内容物	≥3g	最少 0.05g。建议客户自己取内容物，可以用 PBS 冲洗。

提醒

1 因为qPCR绝对定量最终得到的是单位重量，或是单位体积目标基因的拷贝数，所以如果客户送DNA，建议客户记录抽提DNA时样本的使用重量或是体积，方便后继对数据进行转化。

2 送样时请尽量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保证运输过程中的低温条件（干冰的挥发消耗量约为 3-4 公斤/天）。在打包时放入足量的干冰， 将样本埋入干冰中， 为了保持冰盒中的低温环境，建议采用加厚的泡沫盒

 7 qPCR结果

标准曲线

扩增曲线

熔解曲线

定量结果

微基编号	拷贝数	样本稀释倍数	抽提样本重量（g）	基因组DNA体积（μL）	原始样本目标基因拷贝数copies/μL DNA	原始样本目标基因平均拷贝数copies/μL DNA	原始样本目标基因拷贝数copies/g样本	原始样本目标基因平均拷贝数copies/g样本
1	1.08E+06	200	0.237	50	2.17E+08	2.26E+08	4.58E+10	4.76E+10
1	1.23E+06	200	0.237	50	2.47E+08		5.20E+10
1	1.07E+06	200	0.237	50	2.14E+08		4.51E+10
2	7.28E+05	200	0.24	50	1.46E+08	1.49E+08	3.03E+10	3.09E+10
2	7.55E+05	200	0.24	50	1.51E+08		3.15E+10
2	7.44E+05	200	0.24	50	1.49E+08		3.10E+10
3	1.24E+06	200	0.25	50	2.48E+08	2.59E+08	4.96E+10	5.19E+10
3	1.35E+06	200	0.25	50	2.69E+08		5.39E+10
3	1.30E+06	200	0.25	50	2.61E+08		5.21E+10
4	1.61E+06	200	0.234	50	3.21E+08	3.22E+08	6.87E+10	6.87E+10
4	1.60E+06	200	0.234	50	3.19E+08		6.82E+10
4	1.62E+06	200	0.234	50	3.24E+08		6.93E+10
5	1.27E+05	200	0.175	50	2.54E+07	2.66E+07	7.25E+09	7.59E+09
5	1.33E+05	200	0.175	50	2.66E+07		7.61E+09
5	1.39E+05	200	0.175	50	2.77E+07		7.91E+09

 8 术语解释

Ct值（Cyclethreshold，循环阈值）：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
荧光阈值（threshold）的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10*SDcycle3-15
基线（baseline）：在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，即称为基线。
熔解曲线Tm（TmOfMeltingCurve）：SYBRGreen染料发实验结束后需对qPCR产物加热，随着温度的升高，双链接扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降，将此温度称为Tm值。不同PCR产物Tm值不同，从而可对PCR的特异性进行鉴定。

 9 参考文献

1 Tristano Bacchetti De Gregoris et.al. Improvement of phylum- and class-specific primers for real-time PCR quantification of bacterial taxa.2011. Journal of Microbiological Methods.（厚壁菌门拟杆菌门alpha变形菌gamma变形菌等）

2 Baskar Balakrishnan et.al. Development of a real-time PCR method for quantification of Prevotella histicola from the gut.2017.Anaerobe.（普氏菌）

3 John Penders et.al. Quantification of Bifidobacterium spp., Escherichia coli and Clostridium difficile in faecal samples of breast-fed and formula-fed infants by real-time PCR.2005. FEMS Microbiology Letters.（双歧杆菌艰难梭菌大肠杆菌探针法）

4 Anders Bergstrom et.al. Introducing GUt Low-Density Array (GULDA) – a validated approach for qPCR-based intestinal microbial community analysis.2012. FEMS Microbiology Letters.（多种菌的定量）

特定种类微生物检测，首发于微基生物。

支配这些功能微生物发挥重要功能的基因被称为功能基因，如amoA、dsrB、nxrA、nirK、mcrA、pmoA。目前微基生物已经完成了几十种功能基因的检测，具有成熟的检测技术和分析经验。

 氮循环

氮是生命体核酸与蛋白质必不可少的组成元素。氮素的生物地球化学循环是土壤物质循环的重要组成部分，不仅影响土壤质量以及农田等环境系统的生产力和可持续性，还会影响全球环境变化。氮循环是指氮气、无机氮化合物、有机氮化合物在自然界中相互转化过程的总称，包括氨化作用、硝化作用、反硝化作用、固氮作用等。在不同的过程中，不同的功能基因起着不同的左右，常见的氮循环功能基因如下表所示：

基因名称	编码蛋白质	催化途径	在氮循环中作用
nifH	固氮酶铁蛋白	N2–>NH4+	固氮作用
amoA	氨单加氧酶	NH4+–> NO2–	硝化作用
nxrA	亚硝酸盐氧化酶	NO2––> NO3–	硝化作用
narG	膜靠硝酸盐还原酶	NO3––> NO2–	反硝化作用
napA	可溶性细胞质硝酸盐还原酶	NO3––> NO2–	反硝化作用
nirK	含铜离子的亚硝酸盐还原酶	NO2––> NO–	反硝化作用
nirS	含细胞色素cd1亚硝酸盐还原酶	NO2––> NO–	反硝化作用
norB	NO 还原酶	NO–> N2O	反硝化作用
nosZ	N2O还原酶	N2O –> N2	反硝化作用

 碳循环

 结果展示

碳是生命物质的主要元素之一，是有机质的重要组成部分。碳元素在大气、陆地、海洋等各大碳库之间不断循环变化。在大气中，碳主要以CO2和CH4等气体形式存在，在水中主要为碳酸根离子，在岩石圈中是碳酸盐岩石和沉积物的主要成分，在陆地中则以各种有机物或无机物形式存在于植被和土壤中。碳循环中的主要功能基因如下表所示：

微生物名称	基因名称	编码蛋白质	催化途径	在碳循环中的作用
固碳微生物	cbbL	固碳酶 RubisCO	CO2àCH2O	固碳作用
	cbbM
产甲烷菌	mcrA	甲基辅酶M还原酶基因	CH2OàCH4	甲烷产生
甲烷氧化菌	pmoA	甲烷单加氧酶基因	CH4àCO2	甲烷氧化

 硫循环

硫是自然界中最丰富的元素之一，它以不同形式存在，这些不同形式的硫在微生物作用下，可以相互转化，构成了硫的地球化学循环。
微生物在硫循环过程中的作用途径主要有3条，1）是含硫有机物的脱硫作用，2）还原性无机硫的氧化作用力，3）硫酸盐的还原作用。其中硫酸盐还原菌（SRB）和硫氧化菌（SOB）是推动硫循环的重用微生物。常见的硫循环相关的功能基因有：

土壤硫循环中主要功能基因列表

微生物名称	基因名称	编码蛋白质	催化途径	在硫循环中的作用
硫酸盐还原菌	dsrA	异化型亚硫酸盐还原酶	硫酸盐à硫化氢	还原作用
硫酸盐还原菌	dsrB	异化型亚硫酸盐还原酶	硫酸盐à硫化氢	还原作用
硫氧化菌	soxB		硫化物à硫酸	氧化作用

 其他功能基因

功能微生物在自然界中积极的参与着地球化学循环。除了常见的碳循环、氮循环、硫循环功能微生物外，还有一些其他功能微生物起着重要的作用，比如参与磷循环微生物、厌氧氨氧化微生物等等。

微基生物积累了丰富的功能微生物检测经验，如果你有其他的功能基因要检测，可以把功能基因文献或引物发给我们，我们进行评估检测。

 检测类型：

土壤、淤泥、水体等。

 检测方法：

二代高通量测序、实时荧光定量PCR。

 样本采集耗材：

为客户提供样本采集保存耗材，包括土壤样本常温保存液、取样勺和保存管。

 送样要求：

土壤每样本需1g，新鲜取样，冻存于-80℃，保存期间切忌反复冻融，送样时请使用干冰运输；
若采用常温采集保存耗材，常温寄送即可。
海水、湖水等水样建议一个样本取500-1000ml，过滤0.22um滤膜，把滤膜放入无菌管，-80℃保存，干冰寄送。
如果是污水等，建议一个样本取50-100ml，将样本放入无菌管中，-80℃保存，干冰寄送。
如一个样本检测多个功能基因，取样量建议咨询技术支持。

 技术路线：

 生物信息分析流程

 客户发表文献：

1：Hailu Wu, Xinze Wang, Xiaojuan He, et al. Effects of root exudates on denitrifier gene abundance, community structure and activity in a micro-polluted constructed wetland. Science of the Total Environment. 2017, 89:697-703.

2：Hailu Wu, Xinze Wang and XIaojun He. Effects of Selected Root Exudate Components on Nitrogen Removal and Development of Denitrifying Bacteria in Constructed Wetlands. Water. 2017, 9.

3: Congyan Wang, Jiawei Zhou, Jun Liu, et al. Responses of soil N-fixing bacteria communities to Amaranthus retroflexus invasion under different forms of N deposition. Agriculture, Ecosystems and Environment. 2017, 247: 329-336.

4：Congyan Wang, Kun Jiang, Jiawei Zhou, et al. Solidago canadensis invasion affects soil N-fixing bacterial communities in heterogeneous landscapes in urban ecosystems in East China. Science of The Total Environment. 2018,631: 702-713.

5：Cai Hui, Xiaoxiao Guo, Pengfei Sun, et al. Depth-specific distribution and diversity of nitrite-dependent anaerobic ammonium and methane-oxidizing bacteria in upland-cropping soil under different fertilizer treatments. Applied Soil Ecology. 2017, 113:117-126.

6：Xiaoming Lu, Pengzhen Lu and Ke Yang. Restoration using Azolla imbricata increases nitrogen functional bacterial groups and genes in soil. Applied Microbiology and Biotechnology. 2017,101: 3849-3859.

7: Sijie Wu, Ruili Li, Shuguang Xie, et al. Depth-related change of sulfate-reducing bacteria community in mangrove sediments: The influence of heavy metal contamination. Marine Pollution Bulletin.2019, 140:443-450.

8: Shuquan Peng, Fan Wang, Xibing Li, et al. A microbial method for improving salt swelling behavior of sulfate saline soil by an experimental study. Alexandria Engineering Journal. 2019, 58:1353-1366.

特定功能微生物多样性分析，首发于微基生物。

 1 检测样本

粪便、水样、土壤、雾霾、细菌等 

若客户提供DNA，建议客户记录抽提DNA时样本的使用重量或是体积，方便后继对数据进行转化。

 2 检测平台

qPCR定量检测平台，能够检测300多种抗生素抗性基因。

 3 检测服务

绝对定量检测服务：
是测定目的基因在样本中的分子数目，通过构建标准曲线对未知模板进行分子数目的定量，即通常所说的拷贝数。

相对定量检测：
测定目的基因在样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的绝对拷贝数，一般是通过CT值之差来计算。

 4 检测方法

SYBRGreenⅠ法：

嵌入到双链DNA分子后在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后构象发生变化，能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光；而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

TaqMan探针法：

扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步

 5 qPCR的实验流程

 6 部分基因列表如下：

Gene	Classification	Mechanism
catA1、catB3、cfr等	(flor)/(chlor)/(am)phenicol	deactivate
cmlA1、cmx(A)、floR等		efflux
qnrA等		unknown
aac、aacA/aphD、aacC、aacC1、aacC2、aacC4、aadA、aadD、aadE、aph、aph6ia、aphA1(akakanR)、spcN-01、spcN-02、str、strA、strB等	Aminoglycosides	deactivate
ampC/blaDHA、ampC、bla1、blaCMY、blaCTX、blaGES、bla-L1、blaMOX/blaCMY、blaOCH、blaOKP、blaOXA1/blaOXA30、blaOXY、blaPAO、blaPER、blaPSE、blaROB、blaSFO、blaSHV-01、blaTEM、blaTLA、blaVEB、blaVIM、blaZ、cepA、cfiA、cfxA、cphA、fox5、NDM1、ampC等	Beta_Lactamas	deactivate
mecA、pbp、pbp2x、Pbp5、penA等	Beta_Lactamas	protection
int等	MGEs	integrase
IS613、tnpA、Tp614等		transposase
ereB、lnuA、lnuB、lnuC、mphA、mphB、mphC、vatB、vatC、vatE、vgb、vgbB等	MLSB	deactivate
carB、ImrA、matA/mel、mdtA、mefA、msrC、oleC、vgaA、vgbB、msrA等		efflux
erm、ermA、ermA/ermTR、ermB、ermC、ermF、ermJ/ermD、ermK、ermT、ermX、ermY等		protection
acrA、adeA、acrF、ceoA、cmeA、cmr、marR、mdetl1、mdtE/yhiU、mepA、mexA、mexD、mexE、mexF、mtrC、mtrD、oprD、oprJ、pmrA、qac、qacA、qacA/qacB、qacH、rarD、sdeB、tolC、ttgB、yceE/mdtG、yceL/mdtH、yidY/mdtL、ttgA、emrD等	Multidrug	efflux
fabK、bacA、bacA、fosB、fosX、sat4等	other	deactivate
imiR、nisB等		unknown
dfrA、folA等	Sulfonamides	deactivate
sul等		protection
tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetJ、tetK、tetL、tetPA、tet、tetV等	Tetracyclines	efflux
tet(32)、tet(36)、tet(36)、tetM、tetO、tetW、tetPB、tetS、tetT、tetQ等		protection
tet(34)、tet(37)、tetU-01、tetX、tet(35)等		unknown
vanA、vanB、vanC、vanG、vanHB、vanHD、vanRA、vanRB、vanRC、vanRD、vanSA、vanSB、vanSC、vanTC、vanTE、vanTG、vanWB、vanWG、vanXA、vanXB、vanXD、vanYB、vanYD等	Vancomycin	protection

 7 qPCR检测送样要求

	样本类型	样品量/例	备注
环境	土壤/沉积物/淤泥	1g
	湖水/海水/河水	1L，用滤膜或离心富集	过 0.22μm 的滤膜，或者 12000rpm 离心，进行富集。
	污水	20ml	若样本清亮则可适当地多取。
	泥水混合样	2ml
	空气	根据实验需要，用无菌滤膜过滤空气。
	发酵物	固体 2g，液体 20ml

	样本类型	样品量/例	备注
人体	粪便	≥3g
	皮肤	5 个采集拭子	采集 5cm*5cm 面积，反复刮取 20 次。
	生殖道	5 个采集拭子	采集阴道口内 4cm 处分泌物， 每个拭子转 3 圈。
	牙菌斑/舌苔	5 个采集拭子	在采集的部位，刮取 10 次左右。
	唾液	10ml
	痰液	10ml 或 2-3 口痰液
	鼻腔	5 个采集拭子	采集鼻腔内粘膜上的分泌物，转 3 圈。
	肺部灌洗液	30ml 富集液	对灌洗液进行离心富集。
	肠道/胃组织	5mm*5mm*3mm 3 块	尽量多一取些。
	血液	3ml 全血	用 EDTA 抗凝管，颠倒 8-10 次。 不建议用肝素。
	尿液	30mL 尿液	取中段尿为宜。
	母乳	5mL
动物	粪便	≥3g	最少 0.05g。
	盲肠/结肠/胃 组织	≥3g	至少 1g，如果实验条件允许，尽可能多的收集样本
	肠道内容物	≥3g	最少 0.05g。建议客户自己取内容物，可以用 PBS 冲洗。

提醒

1 因为qPCR绝对定量最终得到的是单位重量，或是单位体积目标基因的拷贝数，所以如果客户送DNA，建议客户记录抽提DNA时样本的使用重量或是体积，方便后继对数据进行转化。

2 送样时请尽量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保证运输过程中的低温条件（干冰的挥发消耗量约为 3-4 公斤/天）。在打包时放入足量的干冰， 将样本埋入干冰中， 为了保持冰盒中的低温环境，建议采用加厚的泡沫盒

 8 qPCR结果展示

标准曲线

扩增曲线

熔解曲线

定量结果

微基编号	拷贝数	样本稀释倍数	抽提样本重量（g）	基因组DNA体积（μL）	原始样本目标基因拷贝数copies/μL DNA	原始样本目标基因平均拷贝数copies/μL DNA	原始样本目标基因拷贝数copies/g样本	原始样本目标基因平均拷贝数copies/g样本
1	1.08E+06	200	0.237	50	2.17E+08	2.26E+08	4.58E+10	4.76E+10
1	1.23E+06	200	0.237	50	2.47E+08		5.20E+10
1	1.07E+06	200	0.237	50	2.14E+08		4.51E+10
2	7.28E+05	200	0.24	50	1.46E+08	1.49E+08	3.03E+10	3.09E+10
2	7.55E+05	200	0.24	50	1.51E+08		3.15E+10
2	7.44E+05	200	0.24	50	1.49E+08		3.10E+10
3	1.24E+06	200	0.25	50	2.48E+08	2.59E+08	4.96E+10	5.19E+10
3	1.35E+06	200	0.25	50	2.69E+08		5.39E+10
3	1.30E+06	200	0.25	50	2.61E+08		5.21E+10
4	1.61E+06	200	0.234	50	3.21E+08	3.22E+08	6.87E+10	6.87E+10
4	1.60E+06	200	0.234	50	3.19E+08		6.82E+10
4	1.62E+06	200	0.234	50	3.24E+08		6.93E+10
5	1.27E+05	200	0.175	50	2.54E+07	2.66E+07	7.25E+09	7.59E+09
5	1.33E+05	200	0.175	50	2.66E+07		7.61E+09
5	1.39E+05	200	0.175	50	2.77E+07		7.91E+09

 9 参考文献

1ujin gDuan et.al. Gut resistomes, microbiota and antibiotic residues in Chinese patients undergoing antibiotic administration and healthyindividuals.2020. Science of the Total Environment.（研究中国健康人和患者）
抗生素浓度与ARG总丰度呈正相关，与ARG总丰度呈负相关ARGs和细菌群落的多样性，这表明抗生素的使用可以形成抗生素耐药性和肠道细菌群落。cfxA基因作为一种潜在的生物标志物，以区分在中国广泛接受抗生素治疗的患者和健康的个人在患者的肠道中检测并显著富集。

2JieFenget.al.Antibiotic Resistome in alarge-scale healthy human gut microbiota deciphered by metagenomic and network analyses.2017.Environmental microbiology.（不同国家的肠道微生物抗性基因分析）
中国人的肠道样本中ermF、ermB、cfxA、tetQ的显著富集，高于瑞典，可作为中国人中潜在的生物标志物。

抗性基因检测，首发于微基生物。

特定功能基因指的是具有某种特定作用的酶的编码基因，通过对该酶的基因进行qPCR定量，来确定该基因在样本中的拷贝数。
目前研究较多的主要是氮循环过程中每个反应的酶，碳循环，硫相关，砷相关的一些酶的拷贝数信息。

 氮循环相关

氮是生命体核酸与蛋白质必不可少的组成元素。氮素的生物地球化学循环(氮循环)对生命的存在和持续有关键作用，本质上是微生物驱动的氮素转化、利用及循环的过程。氮循环就是指N2、无机氮化合物、有机氮化合物在自然界中相互转化过程的总和，包括氨化作用、硝化作用、反硝化作用、固氮作用等等。
氮循环及相关基因如下图和下表：

参与途径		基因名称
固氮	N2—NH4+	nifH	Nitrogenase	固氮酶
氨化作用	OrgN—NH4+	ureC	Glutamate dehydrogenase	谷氨酸脱氢酶
硝化作用	NH4+—NO2–	amoA	ammonia monooxygenase	氨单加氧酶
	NO2–—NO3–	nxrA	nitrite oxidoreductase	亚硝酸盐氧化还原酶
反硝化作用	NO3–—NO2–	narG	nitrate reductase	硝酸盐还原酶
	NO2–—NO	nirS/nirK	nitrite reductase	亚硝酸盐还原酶
	NO—NO2	norB	nitric oxide reductase	氧化还原酶
	NO2—N2	nosZ	nitrous oxide reductase	氧化亚氮还原酶
厌氧氨氧化	NO2–—N2	hzo	Hydrazine oxidase	联氨氧化酶
异化N还原到铵	NO3–—NO2–	napA	nitrate reductase	硝酸盐还原酶
	NO2–—NH4+	nrfA	c-type cytochrome nitrite reductase	细胞色素c亚硝酸盐还原酶

 碳循环相关

碳循环主要是碳素的固定和转化过程，主要包括碳固定、甲烷产生、甲烷氧化。
自养微生物具有极强的环境适应性和固碳潜力。目前发现的5条主要生物固碳途径中，卡尔文循环是自养生物固定CO2的主要途径，其中核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RubisCO）是卡尔文循环中的关键酶，因此RubisCO及其编码基因被许多学者用于不同生态环境中固碳微生物群落结构和多样性的研究。
产甲烷菌是重要的环境微生物,在自然界的碳素循环中起重要作用。产甲烷菌是一类能够将无机或有机化合物厌氧发酵转化成甲烷和二氧化碳的古细菌。
甲烷氧化菌是甲烷进入大气的重要屏障,利用它降低人为源向大气排放的甲烷量,对于缓解全球温室效应具有潜在价值.
碳循环过程和相关基因如图和下表：

作用		基因名称
碳相关	固碳	cbbL/cbbM	Ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase	核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶/加氧酶
	产生甲烷	mcrA	methyl coenzyme M reduc-tase	甲基辅酶 M 还原酶
	甲烷氧化	pmoA	particulate methane monooxygenase	甲烷氧化单加氧酶

 硫相关和砷相关的检测基因见下表：

作用		基因名称
硫相关	硫酸盐还原	dsrA	dissimilatory sulfite reductase	异化型亚硫酸盐还原酶
		dsrB	dissimilatory sulfite reductase	异化型亚硫酸盐还原酶
	硫氧化	soxB	Sulfur oxidation	硫氧化酶
砷相关	砷氧化	aioA	arsenite (As(III)) oxidase genes	亚砷酸盐氧化酶基因
	砷呼吸还原	arrA	respiratory arsenate (As(V)) reductase genes	呼吸性砷酸盐还原酶基因
	砷解毒还原	arsC	As(V)reductase genes	砷还原酶基因
	砷甲基化	arsM	As(III) methyltransferase genes	砷甲基转移酶基因

 2 qPCR的原理

实时荧光定量PCR技术（Real-timeQuantitativePCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终通过相对定量（与内参基因对比）或绝对定量（通过标准曲线对未知模板进行定量）的方法确定各个样本的本底表达量。

 3 3种荧光试剂的工作原理及区别

SYBRGreenⅠ法：

嵌入到双链DNA分子后在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后构象发生变化，能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光；而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

TaqMan探针法：

扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步

 SYBRGREEN法和TaqMan探针法的区别

方法	优点	缺点
SYBR GREEN法	高灵敏度，操作简单，不影响酶促反应，价格便宜	1与探针法相比，对引物特异性要求较高，需进行熔解曲线分析 2灵敏度相对较低。
TaqMan 探针法	1具有高度特异性 2更高的灵敏度 3可同时检测几种不同的荧光信号的产物	1探针价格较高 2需要不同引物的扩增效率一致，对引物的设计及扩增条件要求比较高

 4 qPCR的实验方法

实验方法	原理	技术应用	相关应用
绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ)	是测定目的基因在样本中的分子数目，通过构建标准曲线对未知模板进行分子数目的定量，即通常所说的拷贝数。	特定微生物的拷贝数检测 特定功能基因的拷贝数检测 特定抗性基因的拷贝数检测	1临床疾病诊断 2动物疾病检测 3食品安全 4科学研究 5应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
相对定量(RelativeQuantification，RQ)	测定目的基因在样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的绝对拷贝数，一般是通过CT值之差来计算。	样本中某种特定微生物拷贝数占全部微生物拷贝数的比例 某种功能基因的微生物拷贝数占全部微生物拷贝数的比例 某种抗性基因拷贝数占全部微生物拷贝数的比例

 相对定量和绝对定量的数据计算方法

标准质粒拷贝数计算：

每微升拷贝数（copies/μl）=[质粒浓度（ng/ul）×10-9×6.02×1023]/克隆产物相对分子质量
原始样本目标基因拷贝数copies/μLDNA=拷贝数*稀释倍数
原始样本目标基因拷贝数copies/g样本=（原始样本目标基因拷贝数copies/μLDNA*基因组DNA体积）/样本抽提重量，（如果客户样本为DNA样本，则不需要计算copies/g样本）

相对定量的计算：

步骤1:内参基因均一化样本差异：Ct目的基因–Ct内参基因=△Ct

步骤2:其他样本和对照样本比较：△Ct处理样本–△Ct对照样本=△△Ct

步骤3:使用公式计算：倍数变化=2-△△Ct

 5 qPCR的实验流程

 6 qPCR检测送样要求

	样本类型	样品量/例	备注
环境	土壤/沉积物/淤泥	1g
	湖水/海水/河水	1L，用滤膜或离心富集	过 0.22μm 的滤膜，或者 12000rpm 离心，进行富集。
	污水	20ml	若样本清亮则可适当地多取。
	泥水混合样	2ml
	空气	根据实验需要，用无菌滤膜过滤空气。
	发酵物	固体 2g，液体 20ml

	样本类型	样品量/例	备注
人体	粪便	≥3g
	皮肤	5 个采集拭子	采集 5cm*5cm 面积，反复刮取 20 次。
	生殖道	5 个采集拭子	采集阴道口内 4cm 处分泌物， 每个拭子转 3 圈。
	牙菌斑/舌苔	5 个采集拭子	在采集的部位，刮取 10 次左右。
	唾液	10ml
	痰液	10ml 或 2-3 口痰液
	鼻腔	5 个采集拭子	采集鼻腔内粘膜上的分泌物，转 3 圈。
	肺部灌洗液	30ml 富集液	对灌洗液进行离心富集。
	肠道/胃组织	5mm*5mm*3mm 3 块	尽量多一取些。
	血液	3ml 全血	用 EDTA 抗凝管，颠倒 8-10 次。 不建议用肝素。
	尿液	30mL 尿液	取中段尿为宜。
	母乳	5mL
动物	粪便	≥3g	最少 0.05g。
	盲肠/结肠/胃 组织	≥3g	至少 1g，如果实验条件允许，尽可能多的收集样本
	肠道内容物	≥3g	最少 0.05g。建议客户自己取内容物，可以用 PBS 冲洗。

提醒

1 因为qPCR绝对定量最终得到的是单位重量，或是单位体积目标基因的拷贝数，所以如果客户送DNA，建议客户记录抽提DNA时样本的使用重量或是体积，方便后继对数据进行转化。

2 送样时请尽量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保证运输过程中的低温条件（干冰的挥发消耗量约为 3-4 公斤/天）。在打包时放入足量的干冰， 将样本埋入干冰中， 为了保持冰盒中的低温环境，建议采用加厚的泡沫盒

 7 qPCR结果

标准曲线

扩增曲线

熔解曲线

定量结果

微基编号	拷贝数	样本稀释倍数	抽提样本重量（g）	基因组DNA体积（μL）	原始样本目标基因拷贝数copies/μL DNA	原始样本目标基因平均拷贝数copies/μL DNA	原始样本目标基因拷贝数copies/g样本	原始样本目标基因平均拷贝数copies/g样本
1	1.08E+06	200	0.237	50	2.17E+08	2.26E+08	4.58E+10	4.76E+10
1	1.23E+06	200	0.237	50	2.47E+08		5.20E+10
1	1.07E+06	200	0.237	50	2.14E+08		4.51E+10
2	7.28E+05	200	0.24	50	1.46E+08	1.49E+08	3.03E+10	3.09E+10
2	7.55E+05	200	0.24	50	1.51E+08		3.15E+10
2	7.44E+05	200	0.24	50	1.49E+08		3.10E+10
3	1.24E+06	200	0.25	50	2.48E+08	2.59E+08	4.96E+10	5.19E+10
3	1.35E+06	200	0.25	50	2.69E+08		5.39E+10
3	1.30E+06	200	0.25	50	2.61E+08		5.21E+10
4	1.61E+06	200	0.234	50	3.21E+08	3.22E+08	6.87E+10	6.87E+10
4	1.60E+06	200	0.234	50	3.19E+08		6.82E+10
4	1.62E+06	200	0.234	50	3.24E+08		6.93E+10
5	1.27E+05	200	0.175	50	2.54E+07	2.66E+07	7.25E+09	7.59E+09
5	1.33E+05	200	0.175	50	2.66E+07		7.61E+09
5	1.39E+05	200	0.175	50	2.77E+07		7.91E+09

 8 术语解释

Ct值（Cyclethreshold，循环阈值）：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
荧光阈值（threshold）的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10*SDcycle3-15
基线（baseline）：在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，即称为基线。
熔解曲线Tm（TmOfMeltingCurve）：SYBRGreen染料发实验结束后需对qPCR产物加热，随着温度的升高，双链接扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降，将此温度称为Tm值。不同PCR产物Tm值不同，从而可对PCR的特异性进行鉴定。

 9 参考文献

1 Dan Chen et.al. Microbial community and metabolism activity in a bioelectrochemical denitrification system under long-term presence of p-nitrophenol.2018.Bioresource Technology.（narG nirK nirS napA）

2 Lei Wang et.al. Responses of bacterial and archaeal communities to nitrate stimulation after oil pollution in mangrove sediment revealed by Illumina sequencing.2016.Marine Pollution Bulletin.（nirK nirS）

3 Hailu Wu et.al . Effects of root exudates on denitrifier gene abundance, community structure and activity in a micro-polluted constructed wetland. 2017.ScienceoftheTotalEnvironment. （nirK nirS）

4 Suresh Kumar Dubeyet.al. Methane production potential and methanogenic archaeal community structure in tropical irrigated Indian paddy soils. 2014.Biol Fertil Soils.（mcrA）

5 Juanli Yun et.al. Diversity, abundance and vertical distribution of methane-oxidizing bacteria (methanotrophs) in the sediments of the Xianghai wetland, Songnen Plain, northeast China .2011.JSoilsSediments.（pmoA）

6 Hongxia Du et.al.Mercury-methylatinggenes dsrB and hgcA insoils/sedim entsofthe Three Gorges Reservoir.2016.Environment Scientifi cPollution Research.（dsrB）

7 Si-Yu Zhang et.al. Si-Yu Zhang Diversity and Abundance of Arsenic Biotransformation Genes in Paddy Soils from Southern China.2015. Enveronmental Science Technology.（砷相关基因）

特定功能基因检测，首发于微基生物。

由于放线菌、双歧杆菌对于人体健康有着重要的作用，因此许多研究人员对于肠道菌群中的放线菌、双歧杆菌特别重视。但用检测细菌通用引物（515F/ 926R）对放线菌进行高通量检测时，检出率较低，对于双歧杆菌甚至检测不出来。

微基生物经过查阅大量国际权威材料，经过优化实验条件，研发出专门针对放线菌的特异性引物，并通过改进、优化序列的拼接程序，提高放线菌特别是双歧杆菌的检出率。

放线菌多样性分析，首发于微基生物。