微基生物采用高通量测序、PCR-DGGE、实时荧光定量PCR等方法，对样本中的DNA进行序列测定，并通过生信统计分析，对大量数据进行处理，揭示肠道中微生物的种类以及它们之间的相对丰度和进化关系，探讨微生物多样性，研究根系微生物与环境间的相关关系。

技术路线：

高通量分析流程

PCR-DGGE分析流程

检测平台：

　　微基生物拥有Illumina MiSeq、Ion PGM、Roche 454高通量测序分析，PacBio第三代高通量测序分析，PCR-DGGE变性梯度凝胶分析，实时荧光定量PCR（Real-time qPCR），克隆文库等检测平台。

样品采集：

　　微基生物为客户提供样品采集的配套工具，如采集盒、保存液、取样勺和保存管等。

送样要求：

样品原样

　　(1)样品类型：根系微生物，新鲜取样，冻存于-80℃

　　(2)样品需求：≥2g

　　(3)样品保存期间切忌反复冻融，送样时请使用冰袋或干冰运输

DNA类型

　　(1) 样品类型： DNA

　　(2) 样品需求量：≥300ng

　　(3) 样品浓度： ≥10ng/μL

　　(4) 样品纯度：OD260/280=1.8-2.0并确保DNA无降解

　　(5) 样品保存期间切忌反复冻融，送样时请使用冰袋或干冰运输

　　(6) 对于本种类型的样品，我们在检测完样品的质量后，进行PCR扩增等后续试验

生物信息与统计学服务：

　　生信分析项目

　　更多微生态方向研究和生物信息方面服务，请详询：400-660-9270

标题：运用PCR-DGGE和焦磷酸测序分析（Roche 454）对红树林湿地和根围古菌的多样性分析

研究领域：根系微生物

分析物种：古菌

研究区域：16S rRNA V4 and V5 regions

研究方法：PCR-DGGE和Roche 454

主要结果：

1. 实验DGGE结果

　　2.两个PCO轴和展示了所有数据集58%的变种，（根围上、中、下古菌菌群的展示）

　　3.采用重测样对16S rRNA的样本宽度和样本测序丰富度曲线

4.运用RDP的分类器算法统计出古菌16S rRNA在三个不同地方的差异

5.根际微生物中不同地方占主导地位OUT的相关关系

6.被检索到的古菌序列的具体分类

原文链接：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22660713

参考文献：

Pires, A. C., D. F. Cleary, A. Almeida, A. Cunha, S. Dealtry, L. C. Mendonca-Hagler, K. Smalla and N. C. Gomes (2012). “Denaturing gradient gel electrophoresis and barcoded pyrosequencing reveal unprecedented archaeal diversity in mangrove sediment and rhizosphere samples.” Appl Environ Microbiol 78(16): 5520-5528.

根系微生物，首发于微基生物。

1、什么是OTU 、PCA、RDA？
　　答：OTU（Operational Taxonomic Units）是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。
　　PCA即主成分分析。将多个变量通过线性变换以选出较少个数重要变量的一种多元统计分析方法。
　　 RDA即冗余分析，对比主成分分析可以发现，其实冗余分析就是约束化的主成分分析。

2、什么是Reads、Run、Barcode？
　　答：Reads: 高通量测序平台产生的序列标签就称为reads。
　　Run：指高通量测序平台单次上机测序反应。
　　Barcode：与Index同义，多指在Roche GS FLX 454测序平台的16S PCR产物的测序过程中接头序列所包含的的用来区分不同样本的序列。

3、什么是高通量测序（NGS）？
　　答：高通量测序技术是对传统Sanger测序革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。

4、高通量测序平台和DGGE分析环境微生物多样性，它们之间的区别？
　　答：一般认为土壤、海洋、肠道等生态系统中的微生物数量繁多、种类多样。传统的培养方法只限于对环境样品中极少部分（0.1%-1%）可培养的微生物类群的研究。 DGGE技术操作复杂、成本高、痕量菌发现困难，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中的优势种群，也无法得到细菌种类的绝对数量。而高通量测序技术能同时对样品中的优势种群及微量的劣势种群进行检测，获得样品中的微生物群落组成，并将其含量进行数字化，而且每个样品的测序量达到普通测序的几百倍，而单条序列的测序费用远低于普通测序。

5、Misq平台和罗氏454平台之间的区别在于？
　　答：罗氏454高通量测序技术能同时对样品中的优势物种、稀有物种及一些未知的物种进行检测，获得样品中的微生物群落组成，并将其含量进行数字化。测序费用比较高，后期数据分析比较麻烦。MiSeq高通量测序平台集中了Roche 454和Illumina HiSeq 2500的优点，不仅可实现对多样品的多个可变区同时测序，而且在测序速度和测序通量上都有进一步提升，而且测序费用相对于罗氏454便宜很多，后继分析没有那么麻烦。

6、做高通量平台分析整个实验周期是多少天？
　　答：根据不同客户的要求，实验周期也不尽相同。我们在接到客户提供的样品后，即刻进行实验，至全部实验及数据分析结束，一般控制在40个工作日内完成。

7、需要多少测序量？
　　答：由于不同环境样品的物种成分、丰度都各不相同，所需的测序量也不一样。我们会根据合作伙伴样品的具体情况及研究目的，进行测序深度数据库检索，给合作伙伴提供合理建议。

8、测序条数？
　　答：我们保证单个样本测序条数高于1.8万条/样本，样本平均测序条数高于3万条/样本。同时可以按照客户需求增加测序条数。

9、实验结果含那些数据？
　　a. 汇总统计全部的测序结果。
　　b. 将全部序列进行比对，进行聚类/OTU划分， 列出每个OTU的代表序列。
　　c. 种属鉴定，与SILVA数据库进行比对，判断每类OTU详细的分类信息。
　　d. 热图分析
　　e. PCA分析
　　f. 根据测序序列与标准菌株序列，建立系统发育树分析。
　　h. VENN 图
　　i. RDA 分析 

PCR-DGGE相关问题

1、什么是DGGE？
　　答：DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 即变性梯度凝胶，是利用DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。

2.DGGE应用领域
　　答：DGGE作为一种成熟的分子生物学技术被广泛应用于生物学、医学等领域。

3、是否可以参与实验？
　　答：公司原则上不允许参与实验的，可以参观实验室。

4、一板DGGE胶的样品量？
　　答：DGGE胶板一般是16个孔，但是由于电泳过程中，胶两侧的电流会影响两边的电泳效果，导致条带扭曲。为了保证后记实验分析的准确性，建议在12个样品以内。

5、样品能否返还？
　　答：根据客户的需求，如果需要返还，由公司工作人员联系客户后寄送。如果不需要返还，我们会在实验完成后60天后将样品进行销毁处理。

6、实验周期？
　　答：根据不同客户的要求，实验周期也不尽相同。我们在接到客户提供的样品后，即刻进行实验，至全部实验及数据分析结束，一般控制在40个工作日内完成。

7、DGGE分析原核微生物多样性，主要分析哪些区域？选择区域的依据是什么?
　　答：公司针对原核微生物的9个高变区域都进行过多样性分析，目前客户做的最多的还是V1-V3区域。我们可以根据客户的要求，选择相应的扩增区域。

8、真核微生物多样性分析，主要做哪些区域？
　　答：真核生物主要是做V1-V3区域。真菌可以针对ITS1、ITS2进行分析。

9、克隆转化能保证多少个有效的测序结果？
　　答：根据客户的要求，每个条带可以提供3个有效序列。

10、DGGE分析微生物群落要做平行样吗?
　　答：DGGE分析环境微生物多样性，一般不需要做平行样。

11、如何保证实验数据的准确性？
　　答：我们在每一步实验操作过程中都会防止各个样品之间出现交叉污染的情况，从基因组DNA提取到最后的克隆转化，我们都严格把关，确保每个数据的准确性和真实性。

12、如果实验数据和预期不符，如何解决？
　　答：如果出现该种情况，我们会综合考虑多种因素，具体解决方案由双方协商解决。

常规样本寄送及保存

　　1、基因组DNA：样品浓度不低于50 ng/ul，总体积不少于20 ul。对于未抽提的基因组DNA，样本量不低于2g.(如土壤、粪便、动物组织、肠道内容物等)
　　2、水样：2L以上水过滤后的滤膜，若环境中微生物丰富，可适当减少水的体积。
　　3、分泌物：2-3 mL（唾液、鼻涕、汗液、泪水等）
　　4、非致病性：如果您的菌体带有致病性，请您提供加热处理后的基因组DNA。我们不接受有致病性的样品。
　　5、寄送温度：推荐干冰低温运输。
　　6、请尽量避免样本送达时间在节假日，以确保您的样本能及时送达。
　　7、特殊样本或珍贵样本请提前联系我公司，经我公司允许后寄送。

常见问题，首发于微基生物。

DGGE作为一种成熟的分子生物学技术被广泛应用于环境科学（土壤、海洋、河流、冰川、淤泥等）、医学（各种疾病治疗前后，病变部位微生物的差异）、人体（鼻咽、口腔、黏膜、肠道）等领域进行微生物多样性分析。

实验流程图：

实验结果

实验结果包括以下内容

1 引物设计

以下是DGGE中常用的引物，我们将根据客户的不同需求，进行针对性的引物设计。

2 基因组DNA抽提电泳检测图

针对客户的样本来源不同，我们针对性优化不同的基因组抽提方法，已达到提取效果最佳。

　　说明：1-8为样本所抽提基因组DNA，上样量3uL；M为1kb Marker上数第一条带为8 kb，中间的亮带为3kb，浓度为30ng/uL，其余为10 ng/uL。

3 目的片段PCR检测

　　说明：1-8为样本，负为负对照（说明我们的实验没有污染，这对分子实验是至关重要的），上样量为5uL；M为DL2000 Marker，上样量3uL。其中亮带为20ng/uL，其余为10 ng/uL。
Reconditioning PCR：

　　第一轮PCR产物将会作为新的模板再进行少数循环的第二轮PCR扩增，这叫做“Reconditioning PCR”。由于在“ Reconditioning PCR”的过程中引物和模板之间的比例始终保持在较高的水平上，因此可以保证引物与模板之间的退火要优先于不同模板之间的退火，消除异源双链（Heteroduplex）污染对于PCR-DGGE图谱的观察和分析。

参考文献：
　　(1)Heteroduplexes in mixed-template amplifications: formation, consequence and elimination by “reconditioning PCR”. 2002. Nucleic Acids Research.
　　(2)不同外源扰动因素对肠道菌群组成结构影响的研究. 上海交通大学 2008 届博士学位论文.

4 DGGE图谱分析

　　4.1 DGGE胶图和条形图
 
　　4.2 戴斯相似性系数

 图注：lane:代表样品编号

　　4.3微生物多样性指数

4.4 UPGAM法进行样品间的聚类分析图

　　常见聚类分析方法有Neighbor Joining、single linkage、complete linkage、upgama、wpgama、centroid、median、ward’s
　　4.5微生物群落的多维定标分析

　　4.6 主成分分析（PCA, Principal Component Analysis）

　　4.7 冗余分析（RDA, Redundancy Analysis）

5 .主要胶条进行割胶

6 割胶条带的DNA回收、二扩及TA克隆

6.1 二扩电泳检测
　　分别取5 μL PCR产物，于1%琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶电泳检测结果如下图所示

　　电泳检测结果显示：PCR产物条带单一，片段大小正确，可进行胶回收。
6.2 胶回收
　　采用AXYGEN 公司的 AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒回收 PCR 产物，取3 μL回收产物进行电泳检测。
6.3 TA连接及转化
　　PCR产物的克隆使用 BioLinker的pED-T载体试剂盒。
6.4 阳性克隆的筛选及测序
　　在平板上随机挑取8个克隆摇菌，菌液进行M13检测，挑取3个阳性克隆进行测序。

7 测序结果汇总

7.1 fasta文件
　　全部测序结果进行整理，去除载体序列，将其整理为fasta格式的序列文件，为后续分析做准备。

7.2克隆子一致性分析（Alignment比对）

一般每个条带送三个克隆子进行测序，那么三个克隆子所测序列的一致性如何，我们通过clonemanager软件进行序列性的分析，如果克隆子的测序结果完全一致，那么会以绿色的覆盖形式表示，若是序列不一致，会是白色区域。如下图所示：

7.3测序结果NCBI的Blast比对汇总表

7.4测序结果的系统发育树分析

 DGGE技术的优缺点

优点：1. 高效，理论上可以分离开一个碱基差异的DNA片段。
　　　2. 方便，不用对样品进行标记
　　　3. 快速，对于已知DGGE条件的样品，可在短时间能获取DGGE图谱
　　　4. 直观，DGGE图谱可直观的反应出样品中个组分的丰富度
　　　5. 稳定，DGGE作为一种成熟的技术，可重复性高
　　　6. 可多样本同时分析，展现各样本的差异
缺点：1. 仅能检测样本中的主要微生物，占总量1%以上的微生物才能被检测到。
　　　2. DGGE只能对200-700bp的片段有效地分离，过大或者过小的片段分离效果都不是很好。
　　　3. 因为仪器数值有上限，对于某些某种主要菌株占比较大又要展现大部分条带的样品，通过DGGE图谱不能很好的反映出各个菌株的丰富度。
　　　4. 不同序列的DNA有可能发生共迁移而导致某些条带会有多种不同的DNA片段
　　　5. 因为某些物种的基因不同拷贝之间存在异质性，即使一个碱基的差别都会使他们分开，而导致不同的条带是相同物种。
　　　6. DGGE技术对微生物的分类鉴定依赖于基因数据库,若数据库中基因序列信息不够丰富,将会限制DGGE的使用。
　　　7. 由于某些种类的16S rDNA不同拷贝之间的多态性问题,可能导致自然群落中细菌数量的过多估计。

送样要求

1 、环境样品基因组DNA

　　1） 请提供浓度大于10ng/uL，总量大于500ng的基因组DNA，DNA纯度较差或降解严重会影响后继的扩增实验。如果方便的话，可提供电子版DNA电泳检测照片及OD260/280比值。
　　2） 样品在保存期间避免反复冻融。
　　3） 送样务必标清楚样品编号，并用parafilm膜对管口进行密封。
　　4）请务必填写完整的送样订单，并用自封袋密封后同样品一起送样，以便收到样品后妥善保存。

2、 环境样品

　　1）送样样品尽量保证新鲜，为了防止微生物死亡或DNA降解，采样后建议立即冰冻保存，如样本极为珍贵，建议采用液氮速冻后-80℃冰箱保存。
　　2）样品在保存期间避免反复冻融。
　　3）若是样品中含有大量的腐殖质酸、重金属等PCR反应抑制剂，请在送样时注明。
　　4）请务必填写完整的送样订单，并用自封袋密封后同样品一起送样，以便收到样品后妥善保存。
送样条件：
以上两种类型的样本，送样时采用干冰保存运输；若是距离较远，建议采用干冰加冰袋，存放于冰盒中。

3、各类未抽提基因组样品的送样量：

　　土壤：3-5 g（干沙土、干粘土、农田土、堆肥、底泥、泥炭土、淤泥等）
　　粪便：3-5 g
　　肠道内容物：3-5 g
　　动物组织：3-5g（鳃、胃粘膜、肠粘膜、口腔黏膜等）
　　分泌物：2-3 mL（唾液、鼻涕、汗液、泪水等）
　　水样：2L以上水过滤后的滤膜，若环境中微生物丰富，可适当减少水的体积。
　　植物内生菌：10-20g叶片；3-5g根系。
　　血液：10mL。
　　叶片：50-100g
　　其他来源的样品请垂询：400-660-9270或邮件：support@tinygene.com,我们会在第一时间回复您！
　　以上用PP材料的epp管或螺口管盛装即可。

PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳），首发于微基生物。