做微生物多样性研究时，大家是不是经常会遇到RDA分析、CCA分析、PCA分析、PCoA分析呀？我们知道它们对物种（基因或功能）的分析具有重要的作用。但是你知道它们代表什么意思？在什么情况下用什么分析吗？

　　近期小编将把这一堆的分析给大家逐个讲解，今天咱们首先从RDA分析入手！

　　（其实上面所提到的分析，本质上都属于排序分析。排序就是在一个可视化的低维空间(通常是二维)重新排列这些样方，使得样方之间的距离最大程度地反映出平面散点图内样方之间的关系信息。）

　　RDA分析其实是小名，它的中文名叫冗余分析，还有个洋气的英文名叫Redundancy Analysis，RDA分析可以将样本和环境因子反映在同一个二维排序图上，从图中可以直观地看出样本分布和环境因子间的关系。

比如下面这张由微基自己完成的图

小编和大家一起来“破解”这张RDA图

（1）在这个图中，箭头表示环境因子。

（2）箭头连线的长度表示该环境因子与样本分布间相关程度的大小，连线越长，相关性越大，反之越小。

（3）箭头连线和排序轴的夹角以及箭头连线之间的夹角表示相关性，锐角表示成正相关关系，钝角则表示成反相关关系。夹角越小，相关性越高。

（4）箭头所指方向表示群落分析指标或环境因子的变化趋势。

　　其实从RDA报告中，还可以看出所有环境因子或某个环境因子对样本的影响，不过由于分析报告“太琐碎”，通常在文献中不会出现，如下图在这个报告中，红色标注内表示所有环境因子对样本变化的整体解释量，绿色标注内则分别表示3个轴具体的解释量。

那怎么看某个环境因子对所有样本的影响呢？这里小编再给大家举个例子

　　在图3中，将变量射线延长，样本垂直投影于射线上，沿着变量箭头方向，环境变量值增大。图中样本Sa3和Sa4所对应的环境变量A值近似相等，A对所有样本影响的大小排序为：Sa1>Sa4≈Sa3>Sa2>Sa5

　　看到这里是不是觉得RDA分析图很强大？！想不想自己动手操作一下？！小编悄悄的告诉你RDA分析图可以用许多软件做，如CANNOCO、R语言的Vegan。

　　另外小编再告诉大家一个秘籍，在做RDA分析时，环境因子的个数要小于物种的个数，否则软件会“罢工”！

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生物信息分析之RDA分析_微基生物，首发于微基生物。

DGGE作为一种成熟的分子生物学技术被广泛应用于环境科学（土壤、海洋、河流、冰川、淤泥等）、医学（各种疾病治疗前后，病变部位微生物的差异）、人体（鼻咽、口腔、黏膜、肠道）等领域进行微生物多样性分析。

实验流程图：

实验结果

实验结果包括以下内容

1 引物设计

以下是DGGE中常用的引物，我们将根据客户的不同需求，进行针对性的引物设计。

2 基因组DNA抽提电泳检测图

针对客户的样本来源不同，我们针对性优化不同的基因组抽提方法，已达到提取效果最佳。

　　说明：1-8为样本所抽提基因组DNA，上样量3uL；M为1kb Marker上数第一条带为8 kb，中间的亮带为3kb，浓度为30ng/uL，其余为10 ng/uL。

3 目的片段PCR检测

　　说明：1-8为样本，负为负对照（说明我们的实验没有污染，这对分子实验是至关重要的），上样量为5uL；M为DL2000 Marker，上样量3uL。其中亮带为20ng/uL，其余为10 ng/uL。
Reconditioning PCR：

　　第一轮PCR产物将会作为新的模板再进行少数循环的第二轮PCR扩增，这叫做“Reconditioning PCR”。由于在“ Reconditioning PCR”的过程中引物和模板之间的比例始终保持在较高的水平上，因此可以保证引物与模板之间的退火要优先于不同模板之间的退火，消除异源双链（Heteroduplex）污染对于PCR-DGGE图谱的观察和分析。

参考文献：
　　(1)Heteroduplexes in mixed-template amplifications: formation, consequence and elimination by “reconditioning PCR”. 2002. Nucleic Acids Research.
　　(2)不同外源扰动因素对肠道菌群组成结构影响的研究. 上海交通大学 2008 届博士学位论文.

4 DGGE图谱分析

　　4.1 DGGE胶图和条形图
 
　　4.2 戴斯相似性系数

 图注：lane:代表样品编号

　　4.3微生物多样性指数

4.4 UPGAM法进行样品间的聚类分析图

　　常见聚类分析方法有Neighbor Joining、single linkage、complete linkage、upgama、wpgama、centroid、median、ward’s
　　4.5微生物群落的多维定标分析

　　4.6 主成分分析（PCA, Principal Component Analysis）

　　4.7 冗余分析（RDA, Redundancy Analysis）

5 .主要胶条进行割胶

6 割胶条带的DNA回收、二扩及TA克隆

6.1 二扩电泳检测
　　分别取5 μL PCR产物，于1%琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶电泳检测结果如下图所示

　　电泳检测结果显示：PCR产物条带单一，片段大小正确，可进行胶回收。
6.2 胶回收
　　采用AXYGEN 公司的 AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒回收 PCR 产物，取3 μL回收产物进行电泳检测。
6.3 TA连接及转化
　　PCR产物的克隆使用 BioLinker的pED-T载体试剂盒。
6.4 阳性克隆的筛选及测序
　　在平板上随机挑取8个克隆摇菌，菌液进行M13检测，挑取3个阳性克隆进行测序。

7 测序结果汇总

7.1 fasta文件
　　全部测序结果进行整理，去除载体序列，将其整理为fasta格式的序列文件，为后续分析做准备。

7.2克隆子一致性分析（Alignment比对）

一般每个条带送三个克隆子进行测序，那么三个克隆子所测序列的一致性如何，我们通过clonemanager软件进行序列性的分析，如果克隆子的测序结果完全一致，那么会以绿色的覆盖形式表示，若是序列不一致，会是白色区域。如下图所示：

7.3测序结果NCBI的Blast比对汇总表

7.4测序结果的系统发育树分析

 DGGE技术的优缺点

优点：1. 高效，理论上可以分离开一个碱基差异的DNA片段。
　　　2. 方便，不用对样品进行标记
　　　3. 快速，对于已知DGGE条件的样品，可在短时间能获取DGGE图谱
　　　4. 直观，DGGE图谱可直观的反应出样品中个组分的丰富度
　　　5. 稳定，DGGE作为一种成熟的技术，可重复性高
　　　6. 可多样本同时分析，展现各样本的差异
缺点：1. 仅能检测样本中的主要微生物，占总量1%以上的微生物才能被检测到。
　　　2. DGGE只能对200-700bp的片段有效地分离，过大或者过小的片段分离效果都不是很好。
　　　3. 因为仪器数值有上限，对于某些某种主要菌株占比较大又要展现大部分条带的样品，通过DGGE图谱不能很好的反映出各个菌株的丰富度。
　　　4. 不同序列的DNA有可能发生共迁移而导致某些条带会有多种不同的DNA片段
　　　5. 因为某些物种的基因不同拷贝之间存在异质性，即使一个碱基的差别都会使他们分开，而导致不同的条带是相同物种。
　　　6. DGGE技术对微生物的分类鉴定依赖于基因数据库,若数据库中基因序列信息不够丰富,将会限制DGGE的使用。
　　　7. 由于某些种类的16S rDNA不同拷贝之间的多态性问题,可能导致自然群落中细菌数量的过多估计。

送样要求

1 、环境样品基因组DNA

　　1） 请提供浓度大于10ng/uL，总量大于500ng的基因组DNA，DNA纯度较差或降解严重会影响后继的扩增实验。如果方便的话，可提供电子版DNA电泳检测照片及OD260/280比值。
　　2） 样品在保存期间避免反复冻融。
　　3） 送样务必标清楚样品编号，并用parafilm膜对管口进行密封。
　　4）请务必填写完整的送样订单，并用自封袋密封后同样品一起送样，以便收到样品后妥善保存。

2、 环境样品

　　1）送样样品尽量保证新鲜，为了防止微生物死亡或DNA降解，采样后建议立即冰冻保存，如样本极为珍贵，建议采用液氮速冻后-80℃冰箱保存。
　　2）样品在保存期间避免反复冻融。
　　3）若是样品中含有大量的腐殖质酸、重金属等PCR反应抑制剂，请在送样时注明。
　　4）请务必填写完整的送样订单，并用自封袋密封后同样品一起送样，以便收到样品后妥善保存。
送样条件：
以上两种类型的样本，送样时采用干冰保存运输；若是距离较远，建议采用干冰加冰袋，存放于冰盒中。

3、各类未抽提基因组样品的送样量：

　　土壤：3-5 g（干沙土、干粘土、农田土、堆肥、底泥、泥炭土、淤泥等）
　　粪便：3-5 g
　　肠道内容物：3-5 g
　　动物组织：3-5g（鳃、胃粘膜、肠粘膜、口腔黏膜等）
　　分泌物：2-3 mL（唾液、鼻涕、汗液、泪水等）
　　水样：2L以上水过滤后的滤膜，若环境中微生物丰富，可适当减少水的体积。
　　植物内生菌：10-20g叶片；3-5g根系。
　　血液：10mL。
　　叶片：50-100g
　　其他来源的样品请垂询：400-660-9270或邮件：support@tinygene.com,我们会在第一时间回复您！
　　以上用PP材料的epp管或螺口管盛装即可。

PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳），首发于微基生物。

RDA分析，即冗余分析，对比主成分分析可以发现，其实冗余分析就是约束化的主成分分析。PCA和RDA的目的都是寻找新的变量来代替原来变量，它们主要区别在于后者样方在排序图中的坐标是环境因子的线性组合。它的优点就是考虑了环境因子对样方的影响，因为有些时候我们想得到在某些特定条件限制下（如海拔高度，PH值，酸碱度，疾病组与健康组等）物种的分布。可以得到哪些物种受特定的环境因子影响。可以得到如某些植被是受海拔高度影响，某些菌受PH值或酸碱度的影响等。

对数据的准备，需要两个矩阵，一个数据矩阵，一个环境矩阵，数据矩阵和pca准备数据相同，环境矩阵形式如下，如果有不能量化的环境因子（如性别，疾病与健康等）联系我们，来量化您的数据。

对数据的要求，样方的个数必须大于环境因子的个数。

RDA分析(Redundancy analysis)，首发于微基生物。