随着现代分子生物技术的蓬勃发展，已解决了不可培养微生物研究的难题，使得肠道微生物的研究进入一个新的阶段，NGS高通量测序技术的发展，研究者可以基于16S rDNA/18S rDNA基因，利用二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术（454 GS FLX，Illimina HiSeq、MiSeq），获得庞大的数据信息，通过生物信息学手段，来分析肠道微生物的多样性，通过统计分析，对大量数据进行PCA和PCoA分析，得出发病前后样本间肠道微生物主要组成成分是否存在差异；并进一步通过RDA分析，找到与环境因子（疾病等）相关的微生物群落组成，从而达到预防疾病的发生的目的。

研究案例：

1、结直肠癌与肠道微生物

Tingting Wang等采用454测序技术研究结直肠癌（CRC）患者与正常人群肠道微生物的菌落组成差异。并结合real-time PCR对相关基因进行分析，最终确定丁酸盐产生菌的减少和一些致病微生物的增加使得CRC患者肠道微生物菌落的失衡。

Structural segregation of gut microbiota between colorectal cancer patients and healthy volunteers. 2012. The ISME Journal

研究对象： CRC患者46人，健康人群56人
研究区域：V3区
测序平台：Roche 454 GS FLX

主要结果：
（1）PCA主成分分析（图a）和PCoA主坐标分析（图b）显示CRC患者与正常人肠道微生物存在差异。蓝色圆圈代表正常人，红色圆圈代表CRC患者

（2）对CRC患者与正常人样本在98%相似水平上OTU的相对丰度进行RDA分析，找到健康人群与CRC疾病患者相关的微生物类群，进行分析与CRC疾病相关的主要微生物类群。有48个OTU可以作一个关键变量与CRC患者和正常人肠道微生物结构差异存在显著相关性。

（3）Heatmap分析：48个OTU的相对丰度作为健康人和CRC患者肠道微生物差异的主要变量，他们在样本中的分布情况见下图。图左侧黑色OTU代表在正常人中相对丰富，红色OTU代表在CRC患者中相对丰富，每个样本的颜色强度代表在所有样本中的相对比率。

2、二型糖尿病与肠道微生物

Larsen等研究二型糖尿病患者肠道微生物与非糖尿病人群的差异，采用454测序技术结合qPCR技术对36个样本肠道微生物进行分析，结果表明二型糖尿病患者厚壁菌门和唆菌纲微生物比例较对照组显著降低，但是变形菌纲微生物丰富。Bacteroidetes与Firmicutes的比例、Bacteroides-Prevotella group 与 C. coccoides-E. rectale group的比例与血糖浓度呈正相关，而与BMI（体重系数）无关。变形菌纲微生物同样与血糖浓度呈正相关。

Gut Microbiota in Human Adults with Type 2 Diabetes Differs from Non-Diabetic Adults. 2010. PLoS One.

研究对象： 二型糖尿病患者18人，正常人18人
研究区域：V4-V6区
测序平台：Roche 454 GS FLX

主要结果：
（1）Rarefaction Curve：确定取样深度是否合理。

(2)PCA主成分分析：分析二型糖尿病患者与正常人肠道微生物在门与纲水平的差异。

3 饮食与肠道微生物

为了研究饮食对肠道微生物群落多样性的影响，Filippo CD等人比较了15个健康欧洲孩子（EU）及14个健康非洲农村孩子（BF）肠道微生物群落的组成。EU的饮食具有典型的西方特色，而BF的食物则能代表传统的非洲乡下的饮食构成。研究人员通过PCR扩增29个粪便样品进行高通量测序。RDP数据库比对结果显示94.2%的reads属于放线菌门（Actinobacteria），拟杆菌门（Bacteroidetes），壁厚菌门（Firmicutes）和变形杆菌门（Proteobacteria），然而它们在EU和BF中的比例具有显著差异。BF肠道中拟杆菌占大部分，而壁厚菌所占比例较低。有趣的是，含有大量纤维素和木聚糖水解基因的Prevotella和Xylanibacter菌株只存在于BF中，并且所占比例较高。

Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. 2010.PNAS.

研究区域：V5-V6区
测序平台：Roche 454 GS FLX

主要结果：
EU（健康欧洲孩子）和BF（健康非洲农村孩子）样本中微生物分布统计
A：BF样本中主要微生物的分布统计；B：EU样本中主要微生物的分布统计；
C：全部样本相似性分析；D：各样本中主要微生物相对丰度统计；
E：各样本中革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的相对丰度统计

4 肥胖与肠道微生物

Turnbaugh PJ等人对胖瘦不同的同卵双胞胎（31对）、异卵双胞胎（23对）及其母亲（46个）共154个个体的肠道微生物进行了研究。结果表明肥胖与肠道门级微生物的变化相关，胖人与瘦人相比，微生物多样性明显降低，拟杆菌门（Bacteroidetes）所占比例较低而放线菌门（Actinobacteria）所占比例较高。

A core gut microbiome in obese and lean twins. 2009. Nature.

研究区域：V2和V6区
测序平台：Roche 454 GS FLX

主要结果：
（1）A：不同胖瘦程度个体中主要门级别微生物分布及样本之间相似性水平分析；
B：第一主成分与主要拟杆菌门（Bacteroidetes）的相关性分析；
C：双胞胎之间，双胞胎与母亲，不相关个体之间微生物功能相似性分析。

（2）根据随机序列取样与物种多样性分析图显示：肥胖人较瘦人体内微生物多样性显著降低。

5 不同个体肠道微生物群落结构

人体肠道微生物群落结构在婴幼儿、成年人和老年人这三类人群中具有显著的差异，这表明随着年龄的增长，肠道菌群也历经了巨大的变化。Claesson MJ等人收集了161位65岁以上老人及9位成年人肠道菌群的样品，进行焦磷酸测序。研究发现68%的个体肠道中最优势菌群为拟杆菌门（Bacteroidetes），平均比例约为57%，壁厚菌门（Firmicutes）所占比例约为40%。但是和一些疾病或健康相关的菌群在不同个体中所占比例差别极大，包括变形杆菌门（Proteobacteria）,放线菌门（Actinobacteria）和Faecalibacteria。老年人的核心微生物组与年青人也有鲜明差异，前者拟杆菌属所占比例更大，梭菌属在两者之间具有不同的丰度模式。分析26组time-0和time-3 month粪便样品，发现85%的个体在这两个时间的微生物组成极其相近，这表明老年人的肠道菌群呈现出时间稳定性。

Composition, variability, and temporal stability of the intestinal microbiota of the elderly. 2011. PNAS.

研究区域：V4区
测序平台：Roche 454 GS FLX

主要结果：
A：本研究老年人与青年人粪便中核心微生物在门、属、梭菌属的丰度统计（与以往研究者研究成果）；
B：本研究老年人粪便中unique微生物与5个数据库青年个体中unique微生物在门、属、梭菌属的丰度统计；
C：本研究中老年人、青年人unique微生物在门、属、梭菌属的丰度统计。

肠道微生物，首发于微基生物。

基于16S rDNA/18S rDNA基因，优化实验方法，增加对痕量微生物的研究，利用二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术（454 GS FLX，Illimina HiSeq、MiSeq）来分析口腔微生物的多样性，得到对微生物多样性、群落结构、种系关系精确的解析，增加人们对口腔健康与疾病相关微生物的认识。

研究案例：

1 口腔不同部位的微生物组

Zaura等基于对3个健康个体口腔牙面、颊、硬腭、舌、唾液5个部位的微生物组进行了测序分析，发现牙齿邻面微生物多样性最高，颊部微生物多样性最低，PCA可以区分牙表面和软组织表面的微生物群落。3个个体的微生物组构成有较大的重叠，1660个序列（占66%测序内容）在3个个体间共同存在。

Defining the healthy “core microbiome” of oral microbial communities.2009.BMC Microbiology.

研究区域：16S rDNA V5-V6区域
测序平台：Roche 454 GS FLX

主要结论：
（1）Veen图说明3个个体口腔不同部位微生物在不同聚类程度下的重叠情况，研究表明，在不同聚类程度下，3个个体的微生物组构成有较大的重叠。

（2）左图为3个个体口腔公有微生物的相对丰度，不同颜色代表不同个体；右图为在门的分类水平上，每个个体口腔不同位点微生物的相对分布情况。

（3）PCA分析口腔不同部位微生物的差异情况，如图可见，PCA可以区分牙表面和软组织表面的微生物群落。

2口腔真菌微生物研究

Ghannoum等应用ITS引物首次鉴定了人类口腔的基本真菌组。健康人的口腔中共检测出74种已培养的真菌属和11种尚未培养的真菌属。假丝酵母菌检出率最高，接下来依次是枝孢菌、酵母菌、短梗霉、黄曲霉、镰孢菌、隐球菌属，其中4种是已知的人体致病菌。

Characterization of the Oral Fungal Microbiome (Mycobiome) in Healthy Individual. 2010. PLoS pathogens.

研究区域：ITS1
测序平台：Roche 454 GS FLX

主要结果
（1）样本中各物种相对丰度统计图

（2）PCoA分析不同样本之前物种的相似情况。

3龋病与口腔微生物研究

Belda-Ferre等测序了2个无龋个体、2个轻度龋个体、2个重度龋个体的龈上菌斑，发现龋病的优势菌并不是变异链球菌，而是由数十个菌种构成的复杂群落。致龋微生物组和正常微生物组在群落结构和基因功能上有显著的鉴别特征，可以作为龋病防治的生物标记；未患龋个体的微生物组是龋病防治的基因资源库，从中可以寻找有效的抗菌肽和益生菌作为新型的抗龋药物。

The oral metagenome in health and disease. 2012. The ISME Journal.

研究区域：宏基因组
测序平台：Roche 454 GS FLX

主要结果：
（1）左图的Heatmap显示口腔中细菌相对丰度及多样性；右图基于COG功能分类系统，每个分类组对编码潜在生态系统的相对贡献。

（2）口腔和成人肠道样本中微生物宏基因组的功能模式图。分类是基于MG-RAST的子系统第二个级别。

4牙周病与口腔微生物

人类口腔中存在大量的微生物，构成一个复杂的生态系统。口腔内病原菌的扩散会引起牙周病，炎症性疾病也是引起心血管疾病的一个危险因素。Liu等人对牙周炎患者和健康人的龈下斑样本的16S rDNA及全基因组进行Roche 454 GS FLX二代测序分析，发现存在一种未培养的TM7物种，牙周炎患者的口腔微生物群落结构与健康人存在差异，说明在疾病状态下，口腔微生物的结构分布会有一定程度的改变。

Deep Sequencing of the Oral Microbiome Reveals Signatures of Periodontal Disease. 2012. PLoS One.

研究区域：V1-V2区
测序平台：Roche 454 GS FLX

主要结果：
（1） 通过Heatmap分析Genus水平不同样本中各物种的相对丰度。

（2）示意图展示由于生活方式改变，导致牙齿和牙龈组织周围相关微生物发生改变，从而使健康的牙齿向牙周炎恶化。
（3）Actinomyces naeslundiiMG1的参考基因组和样本H1、H2的对比分析。

5口腔癌与口腔微生物

Pushalkar等研究了3个口腔扁平细胞癌患者的唾液微生物组，共发现8个门的微生物，主要由厚壁菌门和拟杆菌门微生物组成。微生物多样性极为丰富，包括860个（33%）已知菌种，其中非培养或未归类的菌种占67%，还有15个独特种系型在各患者唾液内都存在，这说明口腔癌的发生伴随有口腔微生物组的结构改变，口腔微生物组有可能用于口腔癌的早期诊断。

Microbial diversity in saliva of oral squamous cell carcinoma. 2010. FEMS.

研究区域：V4-V5区
测序平台：Roche 454 GS FLX

主要结果：
通过VENN图分析不同样本中物种（common/unique）的重复情况：a是口腔癌患者之间；b是对照组之间；c是患者与对照之间。

口腔微生物，首发于微基生物。

基于16S rDNA/18S rDNA基因，优化实验方法，增加对痕量微生物的研究，利用二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术（454 GS FLX，Illimina HiSeq、MiSeq）来分析鼻咽处微生物的多样性，全面认识人体鼻咽部位微生物的多样性及不同人群之间的差异性。

研究案例：

小孩子容易得呼吸性感染，且鼻咽部感染主要发生在秋天和冬天，因此Bogaert等对96个健康的小孩子的鼻咽部微生物进行分析，并比较秋天冬天与春天鼻咽部微生物群落的差异。研究发现鼻咽部共包括13个门，约250个种。其中5个主要门为Proteobacteria (64%)，Firmicutes (21%)，Bacteroidetes (11%)，Actinobacteria (3%) and Fusobacteria (1.4%) ，个体间微生物组成差异很大。不同季节鼻咽部微生物差异显著不同，这些差异与抗生素的使用和病毒协同感染是没有关系的。

Variability and Diversity of Nasopharyngeal Microbiota in Children: A Metagenomic Analysis. 2011. PLoS One.

研究区域：V5-V6区
测序平台：Roche 454 GS FLX

主要结果：
50个来自秋冬季的鼻咽部微生物样本和46个来自春季的鼻咽部微生物样本的微生物组成模式图。

鼻咽微生物，首发于微基生物。

早期的皮肤微生物研究主要采用传统的分离培养方法，来识别和描述微生物群落的组成和多样性。传统方法的偏向性和局限性，使研究者难以正确全面阐明皮肤微生物的群落结构和多样性特点。高通量测序从根本上改变了人们对微生物群落的认识，从系统的角度去分析和认识皮肤微生物的群落及其功能，而不只是关注传统的所谓病原微生物与疾病的关系。

基于16S rDNA/18S rDNA/ITS基因，优化实验方法，增加对痕量微生物的研究，利用二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术（454 GS FLX，Illimina HiSeq、MiSeq）来分析皮肤微生物的多样性，为进一步理解皮肤的健康、疾病和感染等，全面了解皮肤微生物群落的结构特点及其与皮肤组织和环境的相互关系。

研究案例：

1 Capone等对新出生婴儿的皮肤微生物进行研究，发现出生后几天的婴儿皮肤表面微生物发生显著的功能改变。皮肤微生物群落的形成主要在出生后一年内，其微生物的多样性会随着年龄而增加。新生婴儿皮肤主要是Staphylococci，它的显著降低会使得微生物群落均匀性增加。与成年人相同的是婴儿皮肤微生物群落也是出现在特定的部位，与之有差异的是婴儿Firmicutes占主导位置。皮肤表面微生物对于建立皮肤稳态和调节炎症性反应有重要作用，所以早期皮肤微生物的定殖对于皮肤免疫功能的发展至关重要。

Diversity of the human skin microbiome early in life. 2011. J Invest Dermatol.

研究区域：V4-V5区域
测序平台：Roche 454 GS FLX

主要结果：
（1）在Genus水平，根据最主要的17个物种，对不同位点（胳膊、前额、臀部）皮肤微生物进行菌类分析。

（2）对不同的年龄，身体各部位的所部微生物在Genus水平进行统计分析。

（3）RDA分析最重要的10个Genus的微生物与不同年龄样本之间的关系。

2 Blaser等对美国本土居民和委内瑞拉一村庄里的印第安人的112个皮肤样本微生物进行分析，发现包含20个门，主要为Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria 3种，但是研究发现印第安人与美国本土居民皮肤微生物在微生物群落结构上存在差异，这种差异可能是由于地域不同导致环境气候不同、人们的生活模式不同、种族的差异，导致皮肤表面微生物群落的差异。

Distinct cutaneous bacterial assemblages in a sampling of South American Amerindians and US residents. 2013. The ISME Journal.

研究区域：V2区
测序平台：Roche 454 GS FLX

主要结果：
采用PCoA分析不同区域人群皮肤样本与最显著的10个OUT之间的关系。
其中：红色、蓝色、绿色、橙色代表四个不同区域的人群样本，灰色代表丰度最高的前10个OUT，灰色圆圈的大小代表OUT的数目。

皮肤微生物，首发于微基生物。