对于微生物群落多样性分析，基于Roche 454 FLX +、Illumina MiSeq、Ion Torrent PGM等高通量测序平台，对核糖体DNA高变区域，比如16S/18S/ITS等序列或功能基因，比如细菌和古菌的氨氧化酶基因、硫酸盐还原菌的异化型亚硫酸盐还原酶基因进行测序分析，揭示环境样品中众多不同类型微生物种类以及它们之间的相对丰度和进化关系。

　　MiSeq测序系统采用Illumina成熟的TruSeq边合成边测序技术，集扩增、测序和数据分析的测序仪，每次运行能产生超过7 Gb的数据，循环时间短、测序准确，通过专利的可逆终止试剂方法对数百万片段进行平行测序。当dNTP加入时，对荧光标记的终止子成像、切割、到下一个碱基的掺入。由于每个测序循环中四种可逆终止子结合的dNTP都存在，所以自然竞争让掺入偏差最小化。根据每个循环的荧光信号测定直接检出碱基，与其他技术相比大大降低了原始错误率和可靠的碱基检出。

MiSeq新型测序流程：
　　制备文库的DNA起始量可低至50 ng
　　簇生成和测序都在MiSeq上完成
　　最后在内置的仪器计算机上开展数据分析
平台优势：
　　价格低
　　Miseq测序长度长约500bp
　　高通量测序产出高
　　全自动的工作流程
　　最精准的数据质量
应用领域：
　　靶向重测序 (Targeted Resequencing)
　　PCR扩增：基于Nextera的快速文库制备（1.5小时）和36 bp测序
　　高度多重的扩增子测序 (Amplicon Sequencing)
　　杂交捕获 (Hybrid Capture)
　　16S宏基因组 (16S Metagenomics)
　　克隆检验 (Clone Checking)
　　小基因组测序 (Small Genome Sequencing)
　　de novo测序
　　重测序
　　质粒测序
　　RNA测序 (RNA Sequencing)
　　小RNA测序
　　RNA-seq
　　文库质控
　　调控
　　ChIP-seq

Roche 454
工作原理： 
　　454高通量测序是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。
工作流程： 
　　1、文库制备：根据样品的种类和实验目的，将基因组DNA/cDNA片段化处理至300-800bp间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA；
　　2、Emulsion PCR：单链DNA文库被固定在DNA捕获磁珠上，每个磁珠结合了一个独立的单链DNA片断。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增后仍结合在磁珠上的片段既可被回收纯化用于后续的测序实验；
　　3、测序反应：携带DNA片段的磁珠被放入PTP板中供测序反应使用。PTP孔的直径（29um）确保每个孔只能容纳一个珠子（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX中，每个核苷酸依次流入开放的孔洞和DNA捕获磁珠建。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号，并被测序仪CCD照相机所捕获；
　　4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100余万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，并应用于不同领域。
技术特点： 

• 速度快
• 测序读长最长,平均400-500个碱基；
• 准确度高
• 一致性好
• 可以进行Pair－End测序研究；

应用范围：
　　1、全基因组测序
　　2、比较基因组研究
　　3、转录组和基因调节研究
　　4、扩增产物分析

Ion Torrent PGM
应用领域：微生物基因组测序和重测序，靶基因目标（扩增子）区域重测序
扩展性：半导体芯片技术
简捷：自然的生物化学原理
快速：2个小时完成测序
　　Ion Torrent Personal Genome Machine(个人操作基因组测序仪以下简称：PGM™)，相较其他测序技术，更简单、经济和扩展性更好的测序平台。PGM™台式系统配合革新性的半导体芯片技术，使整个平台具有极高的扩展性和快速完成测序的性能。
Ion Torrent技术通过专有的大规模并行半导体感应器，对DNA 复制时产生的离子流，实现直接和实时的检测。当试剂通过集成的流体通路进入 Ion Torrent 半导体芯片中，密布于芯片上的反应孔立即成为上百万个微反应体系。这种独特的流体体系，微体系机械设计和半导体的技术组合，使我们得以快速直接的将遗传信息翻译成数码的 DNA 测序结果，得到大量高质量的测序数据。
　　PGM™服务整合Ion Torrent 的半导体芯片、反应试剂盒、计算机服务器和数据分析套件为您提供最全面最优质的测序服务。
PGM™更高通量，更大价值，其测序通量完全超过其他测序通量高出至少一个数量级。

高通量测序平台，首发于微基生物。

原理
　　在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累计实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
特点
　　检测仪器少，只用一台仪器。
　　检测时间短，只须45分钟～1小时10分钟（试剂各异），而定性PCR须3～4小时，酶免终点定量须6～8小时，荧光终点定量须2～3小时。
　　操作极其简单：前处理后，样本插入仪器一小时后到电脑上来出报告即可，无须开盖，移样本（以前方法），避免污染。
　　结果精确：定性PCR只能定性，很粗略，终点定量PCR由于只能在40个热循环结束后检测荧光，被测荧光达到饱和导致定量不够精确，属于半定量状态。而实时荧光QPCR是在扩增的每时每刻连续检测各样本的荧光值的变化。
应用
　　基因扩增、检测、定量分析； 扩增特异性分析；SNP分析；RFLP多态性分析；单/多基因表达研究；高通量基因表达谱研究。

微基生物其QPCR定量实验流程：
1. 标准曲线的制作
　　标准曲线利用含有qPCR目的片段的质粒为标准基因，具体步骤如下：
　　（1） 选用克隆文库中含有目标基因质粒的摇瓶培养；

根据客户需求，构建标准质粒（16S/18S/ITS/功能基因）

　　（2）试剂盒提取质粒；
　　（3）测定质粒浓度；
　　（4）对质粒的拷贝数进行计算；
　　（5）将质粒DNA进行10倍梯度系列稀释制作标准样品和待测样品一起扩增，得出标准曲线；
　　（6）根据所得标准曲线计算出样品中的基因拷贝数，最后以基因拷贝数每μL为单位进行分析。
2、荧光定量
　　（1）本研究通过荧光定量的方法细菌16S rRNA基因进行定量。引物选取->qPCR。

根据客户需求设计的引物进行实验

　　（2）PCR扩增程序1
3、标准曲线绘制
4、样品中拷贝数测定

实时荧光定量PCR（RT-qPCR），首发于微基生物。

克隆文库构建，首发于微基生物。

DGGE作为一种成熟的分子生物学技术被广泛应用于环境科学（土壤、海洋、河流、冰川、淤泥等）、医学（各种疾病治疗前后，病变部位微生物的差异）、人体（鼻咽、口腔、黏膜、肠道）等领域进行微生物多样性分析。

实验流程图：

实验结果

实验结果包括以下内容

1 引物设计

以下是DGGE中常用的引物，我们将根据客户的不同需求，进行针对性的引物设计。

2 基因组DNA抽提电泳检测图

针对客户的样本来源不同，我们针对性优化不同的基因组抽提方法，已达到提取效果最佳。

　　说明：1-8为样本所抽提基因组DNA，上样量3uL；M为1kb Marker上数第一条带为8 kb，中间的亮带为3kb，浓度为30ng/uL，其余为10 ng/uL。

3 目的片段PCR检测

　　说明：1-8为样本，负为负对照（说明我们的实验没有污染，这对分子实验是至关重要的），上样量为5uL；M为DL2000 Marker，上样量3uL。其中亮带为20ng/uL，其余为10 ng/uL。
Reconditioning PCR：

　　第一轮PCR产物将会作为新的模板再进行少数循环的第二轮PCR扩增，这叫做“Reconditioning PCR”。由于在“ Reconditioning PCR”的过程中引物和模板之间的比例始终保持在较高的水平上，因此可以保证引物与模板之间的退火要优先于不同模板之间的退火，消除异源双链（Heteroduplex）污染对于PCR-DGGE图谱的观察和分析。

参考文献：
　　(1)Heteroduplexes in mixed-template amplifications: formation, consequence and elimination by “reconditioning PCR”. 2002. Nucleic Acids Research.
　　(2)不同外源扰动因素对肠道菌群组成结构影响的研究. 上海交通大学 2008 届博士学位论文.

4 DGGE图谱分析

　　4.1 DGGE胶图和条形图
 
　　4.2 戴斯相似性系数

 图注：lane:代表样品编号

　　4.3微生物多样性指数

4.4 UPGAM法进行样品间的聚类分析图

　　常见聚类分析方法有Neighbor Joining、single linkage、complete linkage、upgama、wpgama、centroid、median、ward’s
　　4.5微生物群落的多维定标分析

　　4.6 主成分分析（PCA, Principal Component Analysis）

　　4.7 冗余分析（RDA, Redundancy Analysis）

5 .主要胶条进行割胶

6 割胶条带的DNA回收、二扩及TA克隆

6.1 二扩电泳检测
　　分别取5 μL PCR产物，于1%琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶电泳检测结果如下图所示

　　电泳检测结果显示：PCR产物条带单一，片段大小正确，可进行胶回收。
6.2 胶回收
　　采用AXYGEN 公司的 AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒回收 PCR 产物，取3 μL回收产物进行电泳检测。
6.3 TA连接及转化
　　PCR产物的克隆使用 BioLinker的pED-T载体试剂盒。
6.4 阳性克隆的筛选及测序
　　在平板上随机挑取8个克隆摇菌，菌液进行M13检测，挑取3个阳性克隆进行测序。

7 测序结果汇总

7.1 fasta文件
　　全部测序结果进行整理，去除载体序列，将其整理为fasta格式的序列文件，为后续分析做准备。

7.2克隆子一致性分析（Alignment比对）

一般每个条带送三个克隆子进行测序，那么三个克隆子所测序列的一致性如何，我们通过clonemanager软件进行序列性的分析，如果克隆子的测序结果完全一致，那么会以绿色的覆盖形式表示，若是序列不一致，会是白色区域。如下图所示：

7.3测序结果NCBI的Blast比对汇总表

7.4测序结果的系统发育树分析

 DGGE技术的优缺点

优点：1. 高效，理论上可以分离开一个碱基差异的DNA片段。
　　　2. 方便，不用对样品进行标记
　　　3. 快速，对于已知DGGE条件的样品，可在短时间能获取DGGE图谱
　　　4. 直观，DGGE图谱可直观的反应出样品中个组分的丰富度
　　　5. 稳定，DGGE作为一种成熟的技术，可重复性高
　　　6. 可多样本同时分析，展现各样本的差异
缺点：1. 仅能检测样本中的主要微生物，占总量1%以上的微生物才能被检测到。
　　　2. DGGE只能对200-700bp的片段有效地分离，过大或者过小的片段分离效果都不是很好。
　　　3. 因为仪器数值有上限，对于某些某种主要菌株占比较大又要展现大部分条带的样品，通过DGGE图谱不能很好的反映出各个菌株的丰富度。
　　　4. 不同序列的DNA有可能发生共迁移而导致某些条带会有多种不同的DNA片段
　　　5. 因为某些物种的基因不同拷贝之间存在异质性，即使一个碱基的差别都会使他们分开，而导致不同的条带是相同物种。
　　　6. DGGE技术对微生物的分类鉴定依赖于基因数据库,若数据库中基因序列信息不够丰富,将会限制DGGE的使用。
　　　7. 由于某些种类的16S rDNA不同拷贝之间的多态性问题,可能导致自然群落中细菌数量的过多估计。

送样要求

1 、环境样品基因组DNA

　　1） 请提供浓度大于10ng/uL，总量大于500ng的基因组DNA，DNA纯度较差或降解严重会影响后继的扩增实验。如果方便的话，可提供电子版DNA电泳检测照片及OD260/280比值。
　　2） 样品在保存期间避免反复冻融。
　　3） 送样务必标清楚样品编号，并用parafilm膜对管口进行密封。
　　4）请务必填写完整的送样订单，并用自封袋密封后同样品一起送样，以便收到样品后妥善保存。

2、 环境样品

　　1）送样样品尽量保证新鲜，为了防止微生物死亡或DNA降解，采样后建议立即冰冻保存，如样本极为珍贵，建议采用液氮速冻后-80℃冰箱保存。
　　2）样品在保存期间避免反复冻融。
　　3）若是样品中含有大量的腐殖质酸、重金属等PCR反应抑制剂，请在送样时注明。
　　4）请务必填写完整的送样订单，并用自封袋密封后同样品一起送样，以便收到样品后妥善保存。
送样条件：
以上两种类型的样本，送样时采用干冰保存运输；若是距离较远，建议采用干冰加冰袋，存放于冰盒中。

3、各类未抽提基因组样品的送样量：

　　土壤：3-5 g（干沙土、干粘土、农田土、堆肥、底泥、泥炭土、淤泥等）
　　粪便：3-5 g
　　肠道内容物：3-5 g
　　动物组织：3-5g（鳃、胃粘膜、肠粘膜、口腔黏膜等）
　　分泌物：2-3 mL（唾液、鼻涕、汗液、泪水等）
　　水样：2L以上水过滤后的滤膜，若环境中微生物丰富，可适当减少水的体积。
　　植物内生菌：10-20g叶片；3-5g根系。
　　血液：10mL。
　　叶片：50-100g
　　其他来源的样品请垂询：400-660-9270或邮件：support@tinygene.com,我们会在第一时间回复您！
　　以上用PP材料的epp管或螺口管盛装即可。

PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳），首发于微基生物。