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微生物种属鉴定及相关分析

luoyuanquan — Sat, 24 Oct 2015 06:18:31 +0000

>分类学分析

在之前的分析步骤中，已经将序列按照其自身的碱基组成的相似性，分归到各OTU 中。在进行分类学分析时，首先，将每一条优质序列都与SILVA 119数据库进行比对，找出其最相近且可信度达80%以上的种属信息。之后，将每一个OTU 中的所有序列进行类比，找出同一OTU 中的不同序列的最近祖先的种属信息。最后，将得到的结果记录在表格文件中。这样做，可以在保留最可能多的信息量的情况下，确保得出信息的准确性。
使用软件：mothur 例表： OTU name 为OTU 编号；
　　第二列至OTUsize列的前一列为各样本的序列在所有OTU 中的含有情况。例如，第二行第二列的数字代表样品A中有多少序列被划分入OTU1 中。
OTUsize 为该OTU 中所含序列的数量；
　　Taxonomy列为OTU 对应的种属信息。种属信息按照分类学水平分为多列，我们将物种的门、纲、目、科、属、种的信息进行了分类分析，便于对数据的筛选提取。例如，需要提取所有含有属信息的OTU 的相关信息，可在excel 中选取属这一列，在工具栏的数据项中，点选筛选，查看该列第一行的单元格，在下拉菜单中的文本筛选项下方的区域内，取消选择“空白” ，点确定，即得到所有含有属信息的OTU信息。
　　注：分类学数据库中会出现一些分类学谱系中的中间等级没有科学名称，以norank 作为标记。分类学比对后根据置信度阈值的筛选，会有某些分类谱系在某一分类级别分值较低，在统计时以Unclassified 标记。
　　将OTU 综合分类表中的信息按照门、纲、目、科、属、种6 个水平分别提取信息，分别统计各样品在不同分类水平上的菌群组成及丰度。
例表：

>群落结构组成柱状图

根据分类学分析结果，可以得知一个或多个样品在各分类水平上的分类学比对情况。在结果中，包含了两个信息：
　　样品中含有何种微生物；
　　样品中各微生物的序列数，即各微生物的相对丰度。
　　因此，可以使用统计学的分析方法，观测样品在不同分类水平上的群落结构。将多个样品的群落结构分析放在一起对比时，还可以观测其变化情况。根据研究对象是单个或多个样品，结果可能会以不同方式展示。通常使用较直观的饼图或柱状图等形式呈现。群落结构的分析可在任一分类水平进行。
软件：基于物种分类信息的数据表，利用R 语言工具作图或在EXCLE 中编辑作图。
参考文献：
Lisa Oberauner, Christin Zachow, Stefan Lackner, et al. The ignored diversity: complex bacterial communities in intensive care units revealed by 16S pyrosequencing. SCIENTIFIC REPORTS. 3 :1413 .DOI: 10.1038/srep01413.(2013)
例图：注：为保证视图效果，建议作图时可将丰度极低的部分合并为other 在图中显示

>多样品相似度树与柱状图组合分析

左边是样品间基于群落组成的层次聚类分析（bray-curtis 算法），右边是样品的群落结构柱状图。
参考文献：
Srinivasan S, Hoffman NG, Morgan MT, Matsen FA, Fiedler TL, et al. (2012) Bacterial Communities in Women with Bacterial Vaginosis: High Resolution Phylogenetic Analyses Reveal Relationships of Microbiota to Clinical Criteria. PLoS ONE 7(6): e37818. doi:10.1371/journal.pone.0037818.
例图：

微生物种属鉴定及相关分析，首发于微基生物。

OTU群落聚类及相关分析

luoyuanquan — Fri, 23 Oct 2015 06:19:10 +0000

　　OTU（Operational Taxonomic Units）是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。在生物信息分析中，一般来说，测序得到的每一条序列来自一个菌。要了解一个样品测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行归类操作（cluster）。通过归类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。根据客户指定的相似度（96%、97%或者98%），对所有序列进行OTU 划分并进行生物信息统计分析。通常在97%的相似水平下的OTU 进行生物信息统计分析。

OTU群落聚类及相关分析，首发于微基生物。

多样性指数统计

luoyuanquan — Thu, 22 Oct 2015 03:09:10 +0000

　　群落生态学中研究微生物多样性，通过单样品的多样性分析（Alpha 多样性）可以反映微生物群落的丰度和多样性，包括一系列统计学分析指数估计环境群落的物种丰度和多样性。

计算菌群丰度（Community richness）的指数有：

　　(1)Chao – the Chao1 estimator (http://www.mothur.org/wiki/Chao)；是用chao1 算法估计样品中所含OTU 数目的指数，chao1 在生态学中常用来估计物种总数，由Chao (1984) 最早提出；本次分析使用计算公式如下：

　　（2）Ace – the ACE estimator (http://www.mothur.org/wiki/Ace)；用来估计群落中OTU 数目的指数，由Chao 提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一，与Chao 1 的算法不同。本次分析使用计算公式如下：

计算菌群多样性（Community diversity）的指数有：

　　（1）Shannon – the Shannon index (http://www.mothur.org/wiki/Shannon)；用来估算样品中微生物多样性指数之一。它与Simpson 多样性指数常用于反映alpha 多样性指数。Shannon 值越大，说明群落多样性越高。

　　（2）Simpson – the Simpson index (http://www.mothur.org/wiki/Simpson)；用来估算样品中微生物多样性指数之一，由Edward Hugh Simpson ( 1949) 提出，在生态学中常用来定量描述一个区域的生物多样性。Simpson 指数值越大，说明群落多样性越低；

分析软件： mothur [1] ( version v.1.30.1 http://www.mothur.org/ wiki/Schloss_SOP #Alpha_ diversity) 指数分析，用于指数评估的OTU 相似水平97% (0.97)

Table：Community richness estimator

Table ：Community diversity estimator

注：由于数据样品较多，此处以图例形式列出部分。

　　其中label： 0.03 即相似水平；

　　ace\chao\ simpson\ simpson：分别代表各个指数；

　　*_lci\ *_hci ：分别表示统计学中的下限和上限值。

样本信息及多样性指数统计结果如下：

Table ：Estimators table

注：

　　Sample ID：样品名称；Reads：被分入所有OTU 中的总优化序列数；

　　OTU：本次实验中该样品优化序列划分得到的OTU 数目；

　　Chao，Ace，Coverage，Shannon，Simpson：分别表示各个指数；

　　0.03：相似性水平为0.97。

参考文献：

[1] Schloss PD, Gevers D, Westcott SL (2011) Reducing the Effects of PCR Amplification and Sequencing Artifacts on 16S rRNA-Based Studies. PLoS ONE 6(12): e27310. doi:10.1371/ journal. pone.0027310.

多样性指数统计，首发于微基生物。

香农指数曲线

luoyuanquan — Wed, 21 Oct 2015 08:04:00 +0000

　　Shannon-Wiener曲线是反映样品中微生物多样性的指数，利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物信息。
软件：使用97%相似度的OTU，利用mothur计算不同随机抽样下的shannon值，利用R语言工具制作曲线图。
参考文献：
Yu Wang, Hua-Fang Sheng, et al. Comparison of the Levels of Bacterial Diversity in Freshwater,Intertidal Wetland, and Marine Sediments by Using Millions of Illumina Tags. Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(23):8264. DOI: 10.1128/AEM.01821-12.

例图：

香农指数曲线

香农指数曲线，首发于微基生物。

稀释性曲线 rarefaction curve

luoyuanquan — Tue, 20 Oct 2015 08:54:54 +0000

　　稀释性曲线是从样本中随机抽取一定数量的个体，统计这些个体所代表的物种数目，并以个体数与物种数来构建曲线。它可以用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。采用对序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU 的数目构建rarefaction curve，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的OTU，反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU。因此，通过作稀释性曲线，可得出样品的测序深度情况。

　　软件：使用97%相似度的OTU，利用mothur 做rarefaction 分析，利用perl 语言工具制作曲线图。

参考文献：

　　Katherine R Amato. et al. Habitat degradation impacts black howler monkey (Alouatta pigra) gastrointestinal microbiomes. The ISME Journal (2013) 7, 1344–1353; doi:10.1038/ismej.

例图：

　　注：横坐标：随机抽取的测序数据量；纵坐标：观测到的OTU 数量。

稀释性曲线 rarefaction curve，首发于微基生物。